蛋白质磷酸化修饰以及生物信息学研究新进展——翻译摘要.doc

蛋白质磷酸化修饰以及生物信息学研究新进展摘要蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，它参与和调控生物体内的许多生命活动。通过蛋白质的磷酸化与去磷酸化，调控信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程。随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。我们介绍了蛋白质磷酸化修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质分析样品的富集及制备、磷酸化蛋白的鉴定及磷酸化位点的预测、蛋白分离后磷酸化蛋白的检测，及蛋白质磷酸化的分子机制，并综述了近年来国内外的主要相关研究进展。同时，我们也会介绍一些关于蛋白质磷酸化的生物信息学研究新进展。Abstract Phosphorylation is one of the most important posttranslational modifications of proteins, which is related tomany activities of life By reversible protein phosphorylation eukaryotes control many cellular processes including signaltransduction, gene expression, and the cell cycle etc As the development and application of the proteomics, the studies of the protein phosphorylation have become more important This article has introduced the main types and functions of theprotein phosphorylation, the enrichment and preparation of phosphoproteins and phosphopeptides, the identification of the phosphopeptides, thedetermination and prediction of the specificphosphorylationsite, the phosphorelated modifications of the proteins, and the progress on studies above as wellAt the same time, we will introduce on protein phosphorylation Bioinformatics Research Progress.几乎所有的蛋白质在合成过程中或合成后都要经过某些形式的翻译后修饰，一些不合适的修饰常常与疾病相关，某些特定的翻译后修饰还被作为疾病的生物标志或治疗的靶标。磷酸化是一种广泛的翻译后修饰， 同时也是原核和真核生物中最重要的调控修饰形式12，由于蛋白质氨基酸侧链加入了一个带有强负电的磷酸基团，发生酯化作用，从而改变了蛋白质的构型、活性及与其他分子相互作用的能力， 在许多生物学过程，如信号传导、基因表达、细胞分裂等的调控中起着重要作用，异常的蛋白质磷酸化通常与癌症有关。在真核生物中，磷酸化主要发生于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等残基；而在细菌中，蛋白质主要通过天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸等残基被磷酸化；有些蛋白质在原核生物和真核生物中均可被磷酸化， 它们的磷酸化位点通常是精氨酸、赖氨酸和半胱氨酸残基。编码蛋白激酶和磷酸酶的基因约占真核生物基因组的24（酵母基因组中约有120个激酶基因和40 个磷酸酶基因，人类基因组中约有500 个激酶基因和100 个磷酸酶基因）。人类蛋白质组中含有10 万多个潜在的磷酸化位点， 大多数磷酸化蛋白含有一个以上的磷酸化位点，并且以不同磷酸化形式的混合物存在，在胞内活性调控中发挥着重要的作用。此外，磷酸化蛋白质是各种磷酸化形式的复合物，而且是动态变化的，所以对磷酸化蛋白质组的定量研究也非常重要。随着磷酸化蛋白质富集手段的发展及用于分析磷酸肽的质谱技术的提高，对磷酸化蛋白质的分析进展迅速。对磷酸化蛋白质组（细胞内所有磷酸化蛋白质的统称）所涉及的磷酸化蛋白种类、磷酸化位点，以及不同条件下各种磷酸化形式的丰度组成的系统研究是目前的热点。 1. 蛋白质磷酸化的主要类型与功能根据磷酸氨基酸残基的不同，可将磷酸化蛋白质分为4 类，即O磷酸盐、N磷酸盐、酰基磷酸盐和S磷酸盐。O磷酸盐是通过羟基氨基酸的磷酸化形成的，如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸、羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化；N磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的； 酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的；而S磷酸盐则通过半胱氨酸磷酸化形成。蛋白质磷酸化具有以下功能：磷酸化参与酶作用机制，在此过程磷酸化为反应中间产物（多为S或N磷酸盐），如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统（PTR）中的组氨酸蛋白激酶（HPr）；磷酸化介导蛋白活性，蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化，如蛋白激酶A（丝氨酸和苏氨酸残基）或不同的受体酪氨酸激酶（酪氨酸残基）；天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离。2 .磷酸化蛋白质分析样品的富集及制备通常在检测和鉴定磷酸化蛋白、定位磷酸化修饰位点，并定量分析不同条件下的磷酸化情况时， 由于很多样品是磷酸化和非磷酸化蛋白质的混合物，磷酸化肽段丰度很低，在质谱鉴定时易被其他肽段掩盖， 所以常常需要对磷酸化蛋白质或肽段富集后再进行鉴定。富集磷酸化蛋白质、肽段的经典方法有金属离子亲和层析（IMAC）3、生物素亲和素富集4、免疫沉淀5和磷酸化抗体亲和层析6等。利用抗体与磷酸化蛋白特异结合是最简单的富集方法，高亲和性抗体可以从复杂混合物中免疫沉淀特定的蛋白。酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体是已知较好的检测抗体， 可通过免疫共沉淀分离纯化酪氨酸磷酸化的蛋白质7。Tilley 等8利用磷酸化酪氨酸抗体对小麦的高分子量谷蛋白进行了Western 印迹分析，发现了酪氨酸磷酸化的高分子量谷蛋白亚基。Pandey 等5利用特异性抗磷酸化酪氨酸抗体研究表皮生长因子（EGF）的信号途径，发现该途径正是靠酪氨酸的磷酸化调节的。EGF 受体的寡聚体在EGF 刺激下，通过其他亚单位的酪氨酸激酶的活性（自体磷酸化）诱导了一个潜在的激酶的活性，使寡聚体受体亚单位磷酸化。SRC 同源体2 结构域（SH2）或磷酸化酪氨酸相互作用结构域（PID）的蛋白被受体激活，特异性结合磷酸化酪氨酸的残基，并被磷酸化。他们进一步采用2 种抗体的混合物分别免疫沉淀HeLa 细胞中受EGF 刺激和未受EGF 刺激的含有磷酸化酪氨酸的蛋白， 鉴定到9 个酪氨酸磷酸化的蛋白对EGF 有特异性应答，其中7 个是已知的EGF 途径中的蛋白，另外2 个蛋白VAV2和STAM2 是未知的。2002 年，磷酸化酪氨酸特异的片段离子扫描技术被用于研究EGF 途径，鉴定到10 个组分，新发现了位于蛋白SHIP2、Hrs、Cbl、STAM 和STAM2 的5 个磷酸化位点9。此外，其他磷酸化残基如丝氨酸和苏氨酸的抗体也有相应的商品。Gronborg 等10用6 种不同的检测丝氨酸和苏氨酸磷酸化蛋白质的抗体对细胞总蛋白质进行免疫沉淀， 其中3 种抗体可对丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白质进行免疫沉淀， 共鉴定出7 个与丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白质。直接作用于磷酸化丝氨酸或磷酸化苏氨酸的抗体也能用于Western 印迹分析，但由于在免疫共沉淀时抗体特异性不高，因而未得到广泛应用。另一种磷酸肽的富集方法是金属离子亲和层析法3。磷酸基团与固相化的金属离子有高亲和力，可被选择性地吸附在上面，富集微量磷酸肽样品1112，可以进行IMAC 纯化的磷酸肽的离线分析与在线的电喷雾质谱分析。由于IMAC 柱会与其他带负电的氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸等相结合， 层析之前应对蛋白样品中所有的羧酸基团进行甲酯化修饰。亲和纯化磷酸肽时需要的起始材料较多， 常采用2 种方法进行。第一种方法是在强碱性环境中加入硫基乙醇，替换丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸基团， 使巯基暴露并与生物素亲和标签相结合， 然后通过链霉素包被的磁珠将磷酸化蛋白或磷酸肽从复合体中分离出来。胱氨酸和甲硫氨酸也可以这种方法进行衍生，在反应之前须用蚁酸处理将其氧化。巯基乙醇处理时最大的缺点是它不能与磷酸化的酪氨酸反应，而且O糖基化的丝氨酸和苏氨酸残基也会被这种方法衍生， 因此需要进一步的实验来确认蛋白是否真的被磷酸化。第二种方法是通过碳二酰乙胺浓缩反应将胱胺加到磷酸基团上， 再通过碘乙酰磁珠对磷酸化蛋白或磷酸肽进行亲和分离。在以上这些基于层析技术的方法中， 层析柱填料的性质是影响富集效果的关键因素。2004 年，Pinkse 等13利用TiO2填料自制层析柱，将自磷酸化蛋白PKG 酶切产物分离后进行在线ESIMS MS 分析， 鉴定出PKG 至少有8 个磷酸化位点， 并发现了Ser26 和Ser44 等2 个新的磷酸化位点。他们认为TiO2填料可与磷酸化肽段高效、特异地结合，可以有效富集磷酸化肽段。Larsen 等14比较了反相树脂与石墨填料柱对磷酸化肽段的分离效果，认为后者可有效滞留磷酸化肽段，更适合磷酸化肽段的富集、分离和鉴定。Steven 等15发现在pH27 左右大部分胰蛋白酶酶切肽段带有2 个正电荷, 而肽段上有一个磷酸化修饰时则带有1 个正电荷，可利用强阳离子交换色谱将其富集，并在HeLa 细胞核中鉴定出967 个蛋白中的2 002 个磷酸化位点， 得到了迄今最大的磷酸化蛋白谱。3. 蛋白分离后磷酸化蛋白的检测可以通过对磷酸化蛋白的选择性染色或标记检测胶中、膜上及层析柱洗脱组分中的磷酸化蛋白质组。胶 膜的染色灵敏度较低，只能检测丰度很高的磷酸化蛋白，但有助于鉴定不同的磷酸化修饰形式（这些不同修饰形式的磷酸化蛋白在凝胶中的迁移形式会略有差别，如形成链状的点等），还可用于检测不同样品之间某些蛋白质是否发生了磷酸化， 以及磷酸化程度明显不同的蛋白。用32P 选择性标记磷酸化蛋白是一种经典的技术，可以通过纯化激酶及32P进行体外标记，或利用32PATP 或32PO43（正磷酸盐）平衡胞内的ATP 水平进行体内标记，然后通过SDSPAGE、2DGE 或薄层层析对蛋白质进行分离， 再经放射自显影或光学成像检测标记的磷酸化蛋白， 单个蛋白点可以从胶上或膜上剪切出来， 也可以从色谱柱中洗脱时收集放射性标记的蛋白质组分。体外检测到的磷酸化蛋白是否具有生物学意义，必须对它在体内的磷酸化情况进行验证， 因为在体外情况下激酶可能会与许多在生理条件下因处于不同的细胞或亚细胞结构而根本无法接触到的蛋白质发生作用，从而得出假阳性结论；蛋白质被32PATP 放射性标记，通常在消化后通过凝胶电泳或薄层层析分离，可以鉴定磷酸化酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸。而体内磷酸化标记研究也取决于机体本身磷酸化的效率及靶蛋白磷酸化与非磷酸化形态之间的平衡关系。如果某一蛋白已经被磷酸基团所饱和， 那么不论激酶的活性如何也不会有放射性标记的磷酸基团插入，因此也检测不到磷酸化蛋白；对于经体32PO43标记的蛋白质，需要通过双向电泳进行高分辨率的分离。如果蛋白或磷酸化的氨基酸残基可以通过荧光试剂衍生， 那么就可以通过HPLC 结合紫外检测鉴定和定量磷酸化残基。LeesMiller 等16利用放射性32P 对人体内的2 种热激蛋白进行了标记，最终鉴定出保守的丝氨酸磷酸化位点。de Carvalho 等17在昆虫细胞表达了人单核细胞中的细胞质磷脂酶A2， 并采用放射性32P 标记法鉴定出磷酸化蛋白及其磷酸化位点。4.蛋白质磷酸化的研究趋势蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程调节着细胞信号转导、细胞分化和细胞生长等几乎所有的生命活动过程， 因此被生动形象地描述为细胞生理活动的分子开关。蛋白质在蛋白激酶作用下发生磷酸化，在磷酸酶的作用下去磷酸化。不同的蛋白激酶可识别和修饰不同蛋白质的不同位点， 扩大了磷酸化蛋白质研究的复杂性，使磷酸化蛋白质成为蛋白质翻译后修饰研究的热点。大量实验已经表明， 生物生长环境的改变可诱导生物体内的蛋白质发生磷酸化， 从而导致细胞内蛋白质的组成和数量发生变化，最终使生物体的生理状态发生改变。因此，当细胞中的蛋白激酶或磷酸酶的活性受到抑制或过表达时， 蛋白质磷酸化过程就会紊乱，从而导致细胞周期调控异常。蛋白质磷酸化的分子机制对于癌症等重大疾病的研究具有相当的指导意义， 已成为生物学研究领域中的热点。随着蛋白质组学技术的不断发展， 蛋白质组学研究已经进入定量分析及功能蛋白质组阶段， 磷酸化修饰成为众多学者关注的重点。现有的磷酸化修饰研究技术只能发现或分析那些结构性磷酸化位点， 而蛋白质功能的变化往往要借助于瞬时的磷酸化变化。因此，瞬时磷酸化修饰研究技术的涌现和突破将是磷酸化蛋白研究的新方向。5. 蛋白质磷酸化的生物信息学研究新进展 蛋白质的时空动力学特征通常由蛋白质的共价修饰来调控. 蛋白质磷酸化是细胞内最重要的及常见的一种修饰方式. 在人类细胞中, 参与蛋白质磷酸化的蛋白激酶超过518 个. 通过把三磷酸腺苷(ATP)水解成二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根基团, 蛋白激酶能够利用ATP 水解得到的能量将磷酸根基团与底物蛋白质上特定的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基形成共价键, 从而改变其底物蛋白的动力学行为, 并调控一系列的生物学过程. 每一种激酶通常特异性地磷酸化其底物蛋白质, 从而保证了细胞是生命活动信号转导的精确性. 为此, 鉴定激酶及其底物是阐明细胞生命活动分子动力学系统工程的基础. 由于实验生物学系统鉴定蛋白质磷酸化需要大量的人力与物力资源,中国科技大学姚雪彪实验室开始通过计算生物学的方法进行包括磷酸化在内的蛋白质共价修饰系统预测。为了预测激酶特异性的磷酸化位点,他们开发了“基于分组打分策略的磷酸化位点预测平台” (GPS, group-based phosphorylationsite predicting and scoring)的1.0 和1.10 版本. 随着计算研究的逐步深入, 发现有两个问题亟待解决: 1) 激酶分类的问题; 2) 预测的假阳性率(falsepositive rate, FPR). 针对以上两个主要的问题, 他们近期对原有的算法进行了较大的改进, 使用JAVA 语言开发了GPS 2.0 软件, 并重新将软件命名为“基于分组打分策略的预测系统”(group-based predictionsystem). 可以相信,GPS 2.0 将为激酶特异性磷酸化位点的预测及细胞生命活动分子动力学的研究提供有力的技术支持。参考文献1 Hunter T Signaling2000 and beyondJ Cell, 2000,100:1131272 Kim J H, Lee J, Oh J, et al Prediction of phosphorylation sitesusing SVMsJ Bioinformatics, 2004,20(17):317931843 Ficarro S B, McCleland M L, Stukenberg P T, et al Phosphoproteome analysis by mass spectrometry and its application to Saccharomyces cerevisiaeJ Nat Biotechnol, 2002,20(3):3013054 Oda Y, Nagasu T, Chait B T Enrichment analysis of phosphorylated proteins as a tool for probing the phosphoproteome J NatBiotechnol, 2001,19(4):3793825 Pandey A, Podtelejnikov A V, Blagoev B, et al Analysis of receptor signaling pathways by mass spectrometry:identification of vav2as a substrate of the epidermal and plateletderived growth factorreceptorsJ Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97(1):1791846 Barria A, Muller D, Derkach V, et al 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