一例规模猪场正常分娩产死胎增加的病原诊断报告.doc

一例规模猪场母猪正常分娩而死胎增加的病原诊断报告 夏 伟1，张宇辉1，马迪杨1，危艳武2，刘长明2（1.哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江 哈尔滨 150069；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001） 吉林省某规模猪场母猪存栏500多头，2012年8月份向笔者反映猪场最近3个月以来经常出现正常分娩的母猪产仔死胎比例增加的现象，母猪未见任何异常症状，而且死亡的胎儿新鲜，体重较大，未见木乃伊化以及畸形；剖检时发现死亡胎儿肺脏充血、出血、水肿、间质增宽；肾脏肿大,充血，脐带出血等病理变化。为了确诊该猪场母猪产仔死胎增加的病因，我们应用PCR,RT-PCR方法对常见的能够引起母猪繁殖障碍的猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、细小病毒(PPV)、日本乙型脑炎病毒（JEV)进行了检测，结果确诊猪繁殖与呼吸综合征变异毒株(HPPRRSV)，俗称高致病蓝耳病病毒是引起本场母猪产死胎增加的主要原因，关于高致病蓝耳病病毒(HP-PRRSV)引起猪群母猪流产风暴和高热性疾病的报道很多，但正常分娩而死胎增加为特征的病例报道较少，临床上发病率较高而没有引起普遍重视。因此本报告对高致病蓝耳病病毒引起猪场群发性、持续性产死胎的临床诊断具有重要的借鉴意义，我们将有关诊断报告如下。1 材料与方法1.1 病料来源采自吉林长春市某猪场死胎病料3头（肺、腹淋、脾），剖杀断奶消瘦仔猪2头（脾、淋巴结）。编号后冷冻运送，-20 保存备用。1.2 酶和其他试剂PCR和RT-PCR扩增试剂盒、饱和酚、Taq DNA聚合酶、dNTPs、EB、DEPC水、TRIZOL(总RNA抽提试剂主要成分苯酚等）、DL 2000 Marker、TaKaRa RNA PCRKit（AMV）Ver.3.0 均购自宝生物工程（大连）有限公司。1.3 引物设计与合成 根据 GenBank 发表的 PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株）、CSFV（猪瘟病毒）、PCV2（圆环病毒2型）、PRV(伪狂犬病毒)、PPV（猪细小病毒）、JEV（猪乙型脑炎病毒）.用 Oligo6.0 软件设计引物，扩增PRRSV的上游引物：5-ACCATGGAGGAGGATCTGCTAAAAC-3；下游引物：5-CTGGTAAGCAGACGTGTTGCG-3，扩增缺失株（高致病性PRRSV毒株）目的片段长度为843 bp；扩增PCV2的上游引物：5-CAGCAAGAAGAATGGAAGAAGCGGA-3，下游引物：5-CCAGGACTACAATATCCGTGTAACT-3，扩增目的片段长度为1 057 bp；扩增CSFV的上游引物：CSFV-F：5-CCTGACGCCACGATT-3，下游引物CSFV-R：5-GGGGACTCC（G） TTGCATATTTTT（T）-3，扩增目的片段长度为603 bp；扩增PRV的上游引物：gEl：5-CCGCGGGCCGTGTTCTTTGT-3和下游引物：gE2：5-CGTGGCCGTTGTGGGTCAT-3，扩增目的片段长度493 bp1；扩增PPV的上游引物P1：5-CGACGAAGCCTACGACAAATAC-3和下游引物P2：5-TGCTGGTAGTGTTCCTGG GTG-3扩增vp2基因的目的片段长1 255 bp2。扩增JEV的上游引物：5-AACAGCATGCAAATCGAAGAC-3，下游引物-CCAGAAACATCACCAGAAGG-3，引物扩增NS1基因的目的片段500bp3；以上引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。1.4 病料处理及核酸提取 将临床病例的组织样品利用研磨器充分研磨，利用MEM营养液进行10倍稀释，然后利用DNA和RNA提取试剂盒进行核酸抽提。1.5 病毒核酸检测1.5.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒的扩增 分别用BIOZOL总RNA提取试剂盒（博日公司）从病毒培养液提取总RNA为模板，采用TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）试剂盒进行RT-PCR扩增，反应条件RT: 50 30 min，94 2 min；PCR：（94 30 s，58 30 s，72 1 min）35个循环，72 延伸7 min，PCR产物经1.2琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.5.2 猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、细小病毒的扩增12 分别用天根生物科技有限公司DNA提取试剂盒，从病毒培养液提取DNA为模板，采用TaKaRa One Step DNA PCR Kit试剂盒进行PCR扩增，反应条件94 2 min；（94 30 s，55 30 s，72 1 min）35个循环，72 延伸10 min，PCR产物经1.2琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.5.3 猪乙型脑炎病毒的扩增3 用提取病料总，溶于无核酸酶水，用反转录酶进行反转录，体系如下：， 缓冲液，反转录酶，。反转录，置于备用。以和为引物，用Taq进行 反应，体系如下：Taq， 和各，。反应参数为： ； ， ， ，个循环； ， ,产物经1.2琼脂糖凝胶电泳鉴定。2 结 果：2.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测结果 进行RT-PCR扩增后,PCR产物用12琼脂糖进行凝胶电泳后在凝胶成像系统中观察，可见到843 bp的基因条带，大小与HP-PRRSV预期基因相符(见图1)。图1：1:1#脾；2:1#肺；3：1#腹淋；4：2#脾；5:2#肺；6:2#腹淋；7:2000bp DNA marker；8:PRRSV阳性对照；9:3#脾；10:3#肺；11:3#腹淋；12：G1脾；13：G2脾2.2 猪圆环病毒2型（PCV2)检测结果 进行PCR扩增后,PCR产物用12琼脂糖进行凝胶电泳后在凝胶成像系统中观察，可见到1057 bp的基因条带，大小与PCV2预期基因相符（见图2）图2：1：1#肺：2：1#腹淋；3：1#脾；4：2#肺；5：2#腹淋；6：2#脾；7：3#肺；8：3#腹淋；9：3#脾；10：G1脾；11：G2脾；12：阳性对照；M：DNA Marker DL2000 2.3 猪瘟（CSFV)、伪狂犬（PRV)、猪细小病毒（PPV）和猪乙型脑炎（JEV)检测结果 将PCR扩增产物用1.2琼脂糖进行凝胶电泳，结果未见到目的基因。2.4 对死胎病料检测结果：送检的3头死胎病料肺脏检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株核酸呈强阳性；判定引起死胎的原因主要病原为高致病性蓝耳病病毒（HP-PRRSV)，结果（见表1）2.5 对剖杀2头断奶仔猪检测结果：猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株核酸均呈强阳性反应（4+）；在保育猪G2脾还检测出猪圆环病毒强阳性，表明该场断奶后消瘦仔猪中有猪高致病性猪蓝耳病病毒与圆环病毒2型混合感染的病例（见表1）。 表1：病原检测结果统计如下编号样品名称猪圆环病毒PCV2猪细小病毒PPV猪伪狂犬病PrV猪瘟病毒CSFV高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV猪乙型脑炎JEV1死胎1-肺-4+2死胎1-腹淋-3死胎1-脾-4+4死胎2-肺- 5死胎2-腹淋-6死胎2-脾-4+7死胎3-肺-4+8死胎3-腹淋-9死胎3-脾-10断奶仔猪G1-脾-4+11断奶仔猪G2-脾4+4+注释：4+为强阳性，2+为中阳性，1+为阳性；为阴性。3、防控建议：根据该猪场流行的病原制定免疫防控措施。3.1母猪免疫：在配种前免疫哈兽研研制的猪高致病蓝耳病弱毒疫苗（HuN4F112株）2头份、猪圆环病毒2型疫苗（LG株）2毫升预防接种。3.2仔猪免疫：2周龄哺乳仔猪免疫哈兽研研制的猪圆环病毒2型疫苗（LG株）1毫升和猪喘气病疫苗（辉瑞研制）2毫升，间隔3周加强免疫一次；仔猪3-4周龄免疫高致病性蓝耳病弱毒疫苗（HuN4F112株）1头份。4、讨论与分析：根据流行病学特点、临床症状、剖检病变以及应用RTPCR检测确诊引起本场母猪正常分娩而死胎增加病原为高致病蓝耳病病毒。推断母猪妊娠后期感染高致病蓝耳病病毒成为阳性带毒者,病毒通过胎盘感染子宫内的仔猪导致死胎的肺脏、脾脏能检测出高致病蓝耳病病毒核酸；断奶消瘦仔猪同样存在高致病性蓝耳病病毒,猪圆环病毒2型混合感染。据猪场技术人员反映猪场在2009年母猪群曾经普免过某进口蓝耳病弱毒疫苗，但疫苗免疫后妊娠后期母猪群出现大面积流产、产仔延迟、全窝死胎、弱仔等现象。疫情平息后至今从未注射过蓝耳病疫苗，这期间母猪群产仔死胎现象一直存在，猪场经常采用中药保健的方式来降低死胎比例，但今年连续几个月死胎比例显著增加，从而引起猪场老板的高度重视。通过调查、检测和分析建议猪场应该避免在母猪妊娠后期注射蓝耳病活疫苗，蓝耳病病毒经胎盘感染胎儿致死，以及新生仔猪带毒已经得到证明。哈尔滨兽医研究所吴东来研究员4,1999年试验证明，3头妊娠母猪产前70-90天鼻腔接种PRRSV CH-1a株105TCID50通过胎盘可感染胎儿，并在9头死胎和2头新生仔猪脾脏和肺脏检测出蓝耳病病毒抗原，与本诊断结果基本一致。但一些猪场对本病认识不清，有许多人认为猪场一旦发生高致病蓝耳病就会产生自然免疫力，该场就不会有蓝耳病发生。这种观点已被这几年惨痛教训证明是错误的，近几年有许多猪场因此倒闭。高致病性蓝耳病之所以在国内传播如此迅猛，与此观点造成的误导关系甚大。另外猪场在发生产死胎和断奶仔猪消瘦症状增多时切记不要草率诊断，应尽早采取血清和病料到权威部门诊断，及早结合病原诊断确立防控方案，以免贻误疫情。1张超范，刘长明，危艳武，I刘霓虹等，致病性猪伪狂犬病病毒PRVJF株的分离与鉴定J.中国预防兽医学报，2008，30（3）：212-215.2张超范，崔尚金，戚亭，陈长木，苗岚