生物芯片的基本原理.doc

第二章 生物芯片的基本原理 2.1 生物芯片的基本概念一般而言，我们所指的芯片是以硅晶体为材料制造的用来存储信息、进行科学计算等用途的半导体器件，如各种计算机芯片。硅芯片是通过电路高低电平来表示逻辑1或逻辑0，不同的0，1组合可以代表自然界的一切信息，从而方便存储。生物电子芯片与硅芯片有很大的相似之处。20世纪70年代，人们发现脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid）处于不同的状态可以代表信息的存在或没有信息。这一发现引起科学家们的极大兴趣，科学家们立即投身到生物电子元件这一研究领域1。80年代初，国际上提出了“生物芯片”这一概念，形象地把微电子集成电路技术与生物活性分子功能结合，提出构建具有生物活性的能够获取存储信息并进行处理和传输的微生物构件（微功能单元），以达到仿生信息处理的目的。在此基础上诞生了“分子电子学”。90年代以来，在美国硅谷又兴起了研究和开发“生物芯片”的热潮12。这一“生物芯片”的概念是指运用大规模集成电路的光刻技术以及生物分子的自组装技术，在一微小芯片上组装成千上万个不同生物分子（DNA，蛋白质，多肽，细胞等）微阵列，实现生物分子信息的快速、并行、大规模检测13。芯片分析的实质是在面积不大的基片表面上有序地点阵排列了一系列固定于一定位置的可寻址的识别分子。结合或反应在相同条件下进行。反应结果用同位素、化学荧光法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪或CCD摄像技术记录。通过计算机软件分析，综合成可读的IC总信息345。芯片分析实际上也是传感器分析的组合。芯片点阵中的每一个单元微点都是一个传感器的探头6。所以传感器技术的精髓往往都被应用于芯片的发展。阵列检测可以大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性。所以芯片技术也是传感器技术的发展。生物芯片的概念来自计算机芯片，但是到90年代初以后，在人类基因组计划的推动下，才得以迅速发展起来。样品处理 目标分子富集 图2.1 生物芯片分析步骤转录文库制备增扩标记数据处理芯片制作配体点阵及固定化放射显影光 化 学电 化 学活 性酶促反应综合信息分析检测洗涤分子间反应或杂交由于最初的生物芯片主要目标是用于DNA序列的测定，基因表达谱鉴定(gene expression profile comparison)和基因突变的检测和分析，所以它又被称为DNA芯片或基因芯片17。但目前这一技术已派生出蛋白质芯片(protein chip)、细胞芯片(cell chip)、药物筛选芯片(drug screening chip)、微缩芯片实验室(lab-on-chip)等多种不同功用的芯片，并已扩展至免疫反应、受体结合等非核酸领域。所以按现状改称“生物芯片”更能符合发展的趋势。生物芯片分析的过程一般来说包括图2.1所示的一些步骤。90年代的生物分析芯片技术是随着人类基因组研究迅速发展起来的。人类基因组计划的目标是2005年完成对30亿个人体基因组DNA碱基的序列测定，现在通过使用更高级的毛细管阵列测序仪和商业操作，使该计划有望提前完成。1999年4月，美国赛莱拉Celera Genomics公司宣称，他们已经用不同的方法，完成了解读人体遗传密码的工作，现正将它们组合成正确的次序8。2000年6月26日，美、英、法、德、日、中等国科学家一同宣布，人类基因组工作草图已经绘制完成9。随着后基因组时代（post-genome era）的到来，研究者的工作重心从基因组结构方面的研究转向了基因组功能的研究。疾病的研究也转向发病机理方面，及向疾病易感性研究转移。由于上述所有研究都与庞大的DNA信息以及蛋白质信息密切相关，而要处理和比较如此庞大的数据，应用传统的建立在电泳基础上的基因表达、序列测定、突变和多态性检测等研究方法，如mRNA DD和RDA就显得力不从心，迫切需要全新高效的检测手段。生物芯片技术于是应运而生，它是微电子技术和生物基因技术相结合的产物10111213。生物芯片利用微电子和其他一些微细加工工艺，如光学掩模光刻技术(photolithography)、反应离子刻蚀(ion etching)、微注入模塑和聚合膜浇注法等和生物分子自组装技术，把成千上万个不同生物分子集中在一小片基质上，把玻璃、塑料、硅片等不同基质材料上加出用于生物样品制备、反应、检测的微结构。将生命科学研究中不连续的分析过程，如样品制备、化学反应和定性、定量检测等连续化、微型化，以尽量减少空间，加快速度，实现生物分析系统的微型化和芯片化1415。上述分析过程中的某一步或几步微型化集成到一块芯片上就能获得具有特殊功能的生物芯片，如用于样品制备的针对DNA分析的细胞过滤器芯片和介电电泳芯片1617；用于基因突变检测和基因表达测序的DNA微阵列芯片18；用于药物筛选的高通量微米反应池芯片13。生物芯片发展的最终目标是将从样品制备、化学反应到检测的整个生化分析过程集成化以获得所谓的微型全分析系统(micro total analytical system)或称缩微芯片实验室(laboratory on a chip)。2.2 生物芯片的分类生物芯片的形式多种多样。按基质材料分有尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等；以检测的生物信号分，有核酸、蛋白质、生物组织碎片等；按工作原理分类，则有杂交型、合成型、连接型、亲和识别型等35，还有分为被动式生物芯片、电场式主动生物芯片、电磁式生物芯片等19。常用的生物芯片一般分为基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室三大类。而现在很多都是按其功能分，有以下常用芯片19 202122：样品制备芯片、PCR芯片、毛细管电泳芯片、生物电子芯片、药物筛选芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、疾病诊断芯片（肝炎芯片Hepatitis Chip、白血病芯片Leukemia Chip、肺结核芯片TB chip等）、血气检测芯片、多糖芯片、神经元芯片、芯片实验室等。2.3 几种生物芯片的有关进展1、样品制备芯片(sample preparation chip)针对DNA分析，其制备过程通常要经过细胞分离、破胞、脱蛋白等多方面的工作，最后得到纯度足够高的待检DNA23。目前在细胞分离方法上较突出的有过滤分离(根据生物颗粒的尺寸差异进行分离)和介电电泳分离(利用在芯片上所施加的高频非均匀电场使不同的细胞内诱导出偶电极，导致细胞受不同的介电力作用，从而把它们从样品中分离出来)等；芯片中的破胞方法有芯片升温破胞、变压脉冲破胞，以及化学破胞等。在捕获DNA方面，Cepheid公司应用湿法蚀刻和反应离子蚀刻/等离子蚀刻等工艺在硅片上加工出含有5000个高200微米直径20微米的具有细柱式结构的DNA萃取芯片，专门用于DNA的萃取24。2、PCR芯片(PCR chip)由于目前所用检测仪器的灵敏度还不够高，因此从样品中提取的DNA在标记和应用前仍需用PCR(polymerase chain reaction)这样的扩增复制技术复制几十万乃至上百万个相同的DNA片段20。一般PCR芯片的设计思路如图2.2所示，检测的原理是利用基因扩增及序列确定，可同时进行多项检测，由光纤光谱仪和微机分析能准确、灵敏、快速、可靠地确定其特定序列。图2.2 PCR芯片设计思路芯片设计芯片制作温控设计及制造PCR反应杂 交清 洗检 测结果分析总控软件国内南京益来基因医学有限公司25报道的PCR芯片采用汽浴控温进行PCR反应，并与固相微阵列探针进行杂交，通过对杂交信号的分析得到检测结果。他们的PCR芯片操作系统采用基因扩增、杂交、结果分析一体化，操作简便，只需10几分钟。基因只需扩增至pg数量级，相应的减少了试剂如Taq酶的用量，且采用二维扫描方式，基因杂交时可不标记。目前，在芯片中进行核酸扩增反应获得成功的有宾夕法尼亚大学研究小组，美国劳伦斯-利物摩国家实验室和Perkin-Elmer公司3。宾夕法尼亚大学研究小组所做的扩增反应都是在硅玻璃芯片中进行的，芯片的外部加热和冷却采用的是计算机控制的帕尔帖电-热器。在对芯片表面进行惰性处理后，亦即在硅片表面生长一层2000埃的氧化硅之后，他们成功地在硅-玻璃芯片中完成了一系列不同的核酸扩增反应，例如RT-PCR、LCR、多重PCR和DOP-PCR。由劳伦斯-利物摩国家实验室加工的硅芯片所采用的加热方式是芯片内置的薄膜多晶硅加热套，其升降温的速度很快。Perkin-Elmer公司的PCR反应则是在塑料芯片上完成的。伦敦帝国理工大学的研究者研制了一种样品可在不同温度的恒温区间内连续流动的PCR芯片。上述所有工作都是用事先提纯了的DNA或RNA作为扩增反应的底物来完成的26。为了将样品制备和扩增反应集成为一体，宾夕法尼亚大学研究小组最近成功地在坝式微过滤芯片中直接对分离所得的人白细胞通过升温方式胞解后所释放的DNA进行了扩增，这是世界上首例将样品制备和扩增反应集成为一体的研究成果。3、检测芯片 毛细管电泳芯片(CE chip)3毛细管电泳(capillary electrophoresis)是1983年由杜邦公司的Pace开发出来的。随后，瑞士的Ciba-Geigy公司和加拿大的Alberta大学合作利用玻璃芯片毛细管电泳完成了对寡核苷酸(oligonucleotide)的分离。首次用芯片毛细管阵列电泳检测DNA突变和对DNA进行测序的工作是由加利福尼亚大学伯格利分校Mathies领导的研究小组完成的。通过在芯片上加上高压直流电，他们在近两分钟的时间内便完成了从118bp到1353bp的许多DNA片段的快速分离。此外，Mathies的小组与劳伦斯-利物摩国家实验室Nothrup的研究小组合作，报道了首例将核酸扩增反应与芯片毛细管电泳集成为一体所作的多重PCR检测工作。宾夕法尼亚大学Wilding的小组与Ramsey的小组一道用芯片毛细管电泳对芯片中扩增得到的用于杜鑫-贝克肌萎缩诊断的多条DNA片段进行分离也获得了成功。其他用芯片毛细管电泳检测突变的外国公司和学术机构有Perkin-Elmer公司、Caliper Technologies公司、Aclara Biosciences公司和麻省理工等。 DNA突变检测芯片(mutation study chip)DNA之所以能进行杂交是因为核苷A和T、G和C可同时以氢键结合互补成对。许多经典的分子生物学方法如桑格DNA测序法(Sanger sequencing)和PCR等都是以此为基础的。最近出现的几项技术，如用光刻掩膜技术作光引导原位DNA合成27、电子杂交技术、高灵敏度激光扫描荧光检测技术26等，使以杂交为基础的应用有了长足的改善。最近的一些英文权威刊物对应用芯片杂交技术检测突变作了报道。Hacia28等人采用由96000个寡核苷酸探针所组成的杂交芯片，完成了对遗传性乳腺癌和卵巢肿瘤基因BRCA中外显子上的24个异合突变(单核苷突变多态性)的检测。他们通过引入参照信号和被检测信号之间的色差分析使得杂交的特异性和检测灵敏度获得了提高。另外，Kozal等人用高密度HIV寡核苷酸探针芯片对HIV病株的多态性作了分析。Cronin等人用固化有428个探针的芯片对导致肺部囊性纤维化的突变基因进行了检测。用生物芯片作杂交突变检测的美国公司有贝克曼Beckman仪器公司、Abbot Laboratory、Affymetrix、Nanogen、Sarnoff、Genometrix、Vysis、Hyseq、Molecular Dynamics等；英美学术机构有宾夕法尼亚大学、贝勒医学院、牛津大学、Whitehead Institute for Biomedical Research，海军研究室，Argonne国家实验室等。 基因表达分析芯片(gene expression analysis chip)随着人类基因组计划的顺利进行，越来越多的能够表达的人基因序列以及引发疾病和能预测疾病的各种突变正在为人们逐渐认识。为了能够同时对多个可能的遗传突变进行搜寻、加快功能基因组学研究的进程，人们现已把越来越多的注意力放到了能同时提供有关多个基因及其序列信息的所谓并行分子遗传学分析(parallel molecular genetic analysis)方法上。功能基因组学所研究的是在特定组织中、发育的不同阶段或者是疾病的不同时期基因的表达情况。因此它的要求是要能在同一时刻获得多个分子遗传学分析的结果。譬如，许多疾病引发基因可能会有数以百计的与表征有关的特定突变，因而，要求能有同时筛检这些突变的有效方法。另外，任何一个细胞中都会有上千个基因在表达。而细胞间基因表达的差异往往能反应出这些细胞是发育正常还是在朝恶性肿瘤细胞方向发展。采用芯片技术利用杂交对基因表达进行分析的好处是它能用很少的细胞物质便能提供有关多基因差异表达的信息，从而给疾病诊断和药物筛选提供前所未有的信息量28。Lockhart等人采用固化有65000个不同序列的长度为20个核苷的探针芯片，定量地分析了一个小鼠T细胞线中整个RNA群体内21个各不相同的信使RNA。这些专门设计的探针能与114个已知的小鼠基因杂交。分析发现在诱发生成细胞分裂后，另外有20个信使RNA的表达也发生了改变。检测结果表明该系统对RNA的检出率为1300000，对信使RNA的定量基准为130029。Wang等人在研究表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(etoposide)诱导的细胞程序性死亡时，利用DNA芯片技术，制备了一次可检测6591种人细胞信使RNA的寡聚核苷酸微阵列，检测到诱导后的细胞内有62种信使RNA的量发生了变化。通过挑选12个与诱导作用有关的基因作进一步研究，它们发现了2个新的p53靶基因。DeRisi等人将一个恶性肿瘤细胞线中得到的870个不同的cDNA探针通过机械手“刷印”至载玻片上以观察癌基因的表达情况。在比较两个标有不同荧光标记的细胞信使RNA群的杂交结果之后，他们对引入正常人染色体后肿瘤基因受到抑制的细胞中的基因表达结果进行了分析30。另外，Shoe-maker等人报道了一种利用生物芯片来确定许多新近发现的酶母基因的生物功能的所谓分子条形编码技术。这种技术的好处是它能让我们以并行的方式定量地分析很复杂的核酸混合物。Lueking等人最近采用蛋白质微阵列技术，把作为探针的蛋白质高密度地固定在聚双氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride)上，并检测到了10pg的微量蛋白质测试样。对92个人cDNA克隆片段表达的产物进行检测，用单克隆技术作平行分析，证实了假阳性的检出率低。由于蛋白质微阵列技术不受限于抗原-抗体系统，故能为高效筛选基因表达产物及研究受体-配体的相互作用提供一条新的有效途径31。 DNA测序芯片基因芯片技术中的杂交测序技术（SBH, sequencing by hybridization）及邻堆杂交技术（CSH）是一种高效快速的测序技术。SBH技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高，但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加这提高了微阵列的复杂性，降低了杂交的准确性。CSH技术弥补了SBH技术的弊端，CSH技术的应用增加了测序的准确性，可进行较长的DNA测序。通过杂交分析DNA的另一应用技术是重复测序。那么，重复测序是怎么工作的呢？首先，人们将长度为8-20个核苷的探针合成并固定到指甲盖大小的硅芯片或玻璃芯片上。当含有与探针序列互补的DNA被置于联有探针的芯片之后，固化探针就会通过与其序列互补的DNA片段杂交而结合13。通过使用带有计算机的荧光检测系统对“棋盘”每个格子上的荧光强弱及根据每个格子上已知探针的序列进行分析与组合就可得知样品DNA所含有的碱基序列。美国的Science杂志对应用芯片杂交技术测序作了报道。Chee等人在一块固化有135000个寡核苷酸探针(每个探针长度为25个核苷)的硅芯片上对长度为16.6kbp的整个人线粒体DNA作了序列重复测定。每个探针之间的空间间隔为35微米。测序精度为99%。另外Hacia还报道了一种微测序分析法(minisequencing-based assays)，为检测所有可能的碱基序列变化提供了强有力的手段。此方法中需要将不同颜色荧光染料标记的四种ddNTP，加入到引物的酶促反应中，微阵列上固化的寡核苷酸用作酶促反应的引物，靶序列作为模板，可检测到靶序列上的碱基变化。4、蛋白质芯片(protein chip)生物科学正迅速地演变为一门信息科学，基因芯片作为成功的例子，已广泛应用于生物基础研究及临床医学各领域。然而基因芯片只能检测到人体各种遗传信息在DNA/RNA水平的变化，而无法检测出在蛋白质水平上的变化。同时基因芯片的制作和检测费时，所需探针必须人工合成，必须经PCR扩增过程，还要进行昂贵的荧光标记。随着人类基因组计划测序工作的完成，下一步将要进入更加复杂的蛋白质功能的研究，迫切需要蛋白质芯片技术。Angelika Lueking和Martin Horn等研究和发展了一个在cDNA微矩阵上进行基因表达谱研究的一种辅助的方法31，这种技术能够在芯片大小的蛋白微矩阵上进行大量的基因表达和抗体筛选。这种技术应用一种带有一种新的转移图章的机械手进行点样，蛋白溶液被高密度的点在聚偏二乙烯二氟（PVDF）膜上。在此膜上能够高灵敏度的检测出经纯化的特殊蛋白。在该试验中，用92个人cDNA克隆在酶标板上表达所得细菌溶胞物作为蛋白质点成芯片，在此芯片上能够可靠地进行纯化的蛋白表达物的检测。假阳性克隆和以不正确阅读框架来表达蛋白的比率低。所挑选克隆产物的特异性在相同的芯片上应用单克隆得到证实。带有一些不相关蛋白的一些抗体的交叉反应表明，用来检测抗体特异性的蛋白质芯片可以对蛋白的整个库进行检测。因为这种应用不仅仅局限在抗原-抗体体系，蛋白质芯片也能够为基因表达和受体-配体相互作用的大量检测提供一个普遍的方法。在基因组和蛋白组的研究中，在整个基因组水平上，蛋白芯片是用来把基因表达分析和分子结合研究的有用工具。如果不同的表达基因用cDNA芯片检测出相同的克隆能够同时分析出在不同的细胞的体系或用原位转移。在同一个蛋白芯片上，表达芯片能用其它蛋白结合进行筛选或不同分子从核酸到小分子配体。这种多样性使蛋白芯片成为诊断的多用途工具。5、生物电子芯片(bioelectronic chip)为了把不同的癌细胞、细菌或病毒从血样、水样或其他液体样品中分离出来，人们设计加工出了用作介电电泳（dielectrophoresis）的生物电子芯片。通过在硅片上制作一系列各种排列的金属电极和在这些电极上施加高频电场就可在不同的细胞内感应出偶极，而偶极的出现又反过来使不同的细胞要么承受正介电力，要么承受负介电力，从而使它们能够从各种液体样品中分离出来。采用二维介电电场分离方法，已成功地实现了对乳腺癌细胞和正常单核白细胞的分离。Nanogen公司研制了采用介电电泳原理用于将大肠杆菌从含有人体血细胞的混合物中分离出来的生物电子芯片，同时此芯片在蛋白酶消化作用下完成对细胞的胞解作用。处理后的大肠杆菌中的DNA或RNA经电寻址导向式杂交在DNA芯片上杂交分析21。Arquint等研制了一种以硅为基底采用微加工技术制作的具有pO2、pCO2和pH传感器供血气检测用硅芯片21。芯片的导体部分都是由标准的硅制作技术构成，上面制作了用于pO2检测的安培型传感器和用于pCO2、pH检测的电位型传感器。聚丙烯酰胺和聚硅氯烷聚合层分别作为内部电解质和气体渗透膜通过光聚合的方法沉积形成。整个传感器以集成电路的制作方式在硅片上完成，适宜于批量生产。流路通道也被直接集成在硅片上，因此减少了样品及试剂的用量，其分析精度适合临床检测的需要。6、药物筛选芯片(drug screening chip)2132以生物芯片为基础的另一个很有价值得研究方向是以生物芯片技术所具有的高集成度与组合化学相结合，为新药研究的初筛提供超高通量筛选。药物筛选要求平行、快速，生物芯片这种高通量、多参数而近乎实时的筛选方式无疑具有巨大的优越性。利用生物芯片可比较正常组织（细胞）及病变组织（细胞）中大量（可达数千）相关的基因表达的变化，从而发现一组疾病相关基因作为药物筛选靶标，这种策略尤其适于病因复杂或尚未定论的情况。例如，恶性肿瘤的发生常常是多基因共同作用的结果，生物芯片技术在肿瘤细胞基因表达模式及肿瘤相关基因发掘中重要的作用。Heller等提取正常及诱发病变得巨噬细胞、软骨细胞系、原代软骨细胞和滑骨细胞的mRNA，用包含细胞因子、趋化因子、DNA结合蛋白及基质降解金属蛋白酶等几大类基因地cDNA在内的芯片进行筛选，发现了数种变化明显的基因。其中除了有已知与类风湿关节炎有关的TNF、IL-1、IL-6、IL-8、RANTES、VCAM外，还有新发现的基质金属弹性蛋白酶HME、IL-3、ICE、趋化因子Gro等。应用生物芯片还可以直接筛选特定的基因文库以寻找药物作用的靶点。对于以将化合物处理细胞后特定一群基因表达变化为靶标的筛选方式，使用cDNA芯片自然是较为合适的；cDNA芯片尚可用于反义寡核苷酸类药物的优选。至于以霉受体、抗体的不能够蛋白分子为靶标的筛选系统，各种类型的蛋白质芯片可以给出十分充足的信息，其灵敏度可达250amol或10pg级。7、芯片实验室(lab-on-chip)将从样品制备、化学反应到检测的整个分析过程集成化是生物芯片发展的最终目标，这就是微型全分析系统，也叫芯片实验室。1998年6月，Nanogen公司的程京博士和他的同事们首次报道了用芯片实验室所实现的从样品制备到反应结果显示的全部分析过程33。他们用这个装置从混有大肠杆菌的血液中成功地分离出了细菌，在高压脉冲破胞之后用蛋白酶K孵化脱蛋白，制得纯化的DNA，最后用另一块电子增强的DNA杂交芯片分析证实提取物是大肠杆菌的DNA。这是向缩微实验室迈进的一个成功的突破33。目前，含有加热器、微泵微阀、微流量控制器、电子化学和电子发光探测器的芯片已经研制出来了，而且，也出现了将样品制备、化学反应和分析检测部分结合的芯片（例如，样品制备和PCR；竞争免疫测定和毛细管电泳分离）。相信不久的将来，包含所有步骤的缩微芯片实验室将不断涌现32。 2.4 小 结生物芯片是八十年代末发展起来的一种新技术，它是将生命科学研究中所涉及的许多分析步骤，利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术，使样品检测、分析过程连续化、集成化、微型化。生物芯片主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，利用生物分子的自组装技术，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。世界上许多政府都投入大量人力、财力、物力进行这场高科技较量。很多著名大公司和实验室也陆续报道了令人振奋的科研进展。参 考 文 献1 Aris Persodis. 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