最终版--杞菊地黄丸实验设计.docx

中药制剂分析设计性实验项目名称杞菊地黄丸（浓缩丸）的质量分析组 长副组长成 员 专业年级所属院(部)填表日期*中医药大学药学院制杞菊地黄丸（浓缩丸）的质量分析1、 实验目的： 1、掌握中药浓缩丸的提取分离方法 2、掌握中药浓缩丸的理化鉴别和含量测定方法2、 实验原理：【处方】枸杞子40g 菊花40g 熟地黄160g 山茱萸（制）80g 牡丹皮60g 山药80g 茯苓60g 泽泻60g【制法】以上八味，取酒萸肉、牡丹皮、山药粉碎成细粉；泽泻、茯苓加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，滤过，滤液合并浓缩至相对密度为1.30-1.35（60-80）的稠膏；熟地黄切片，加水煎煮三次，第一次3小时，第二次2小时，第三次1小时，滤过，滤液合并浓缩至相对密度为1.30-1.35（60-80）的稠膏；枸杞子以45%乙醇作溶剂，剩余的酒萸肉与牡丹皮及菊花以70%乙醇作溶剂，浸渍24h后分别进行渗漉，收集渗漉液，合并上述渗漉液，回收乙醇浓缩至相对密度为1.30-1.35（60-80）的稠膏；与上述细粉与稠膏混匀，制成浓缩丸，干燥，打光，即得。【性状】本品为棕色至棕黑色的浓缩丸，味甜而酸HPLC具有高效、高速和高分辨率的优势。兼有分离和分析的作用，被广泛用于制剂和原料药的有关物质检查以及含量测定，常用外标一点法进行测定。不同药物中含有不同物质，其药理和特性理化性质不同，可用于对某一种或某一类药物的定性鉴别。3、 实验材料： 器材：高效液相仪 分析天平 塞锥形瓶 冷凝管 研钵 量瓶 剪刀 超声处理设备 回流装置（100ml圆底烧瓶，冷凝管，橡皮管，铁架台，夹子等） 100ml具塞锥形瓶 蒸发皿 60ml分液漏斗等 药品：处方中各类药材 丹皮酚对照品 试剂（甲醇 乙酸乙酯 二氯甲烷 石油醚 无水乙醇 乙醚 丙酮 三氯甲烷 甲酸 甲苯 盐酸 冰醋酸 硫酸 环己烷 三氯化铁 香草醛等）实验操作：（一） 含量测定：按照高效液相色谱法（2015年版药典一部附录 D）测定。牡丹皮色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇水（70：30）为流动相；检测波长为274nm。理论板数按丹皮酚峰计算应不低于3500。供试品溶液的制备：取浓缩丸粉末0.5g，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇（70ml甲醇+30ml水）50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33kHz）45分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过（0.45m微孔滤膜），取续滤液，即得。对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20g的溶液，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10l，注入液相色谱仪，测定，即得。标准：本品含牡丹皮以丹皮酚（C9H10O3）计，每1g不得少于1.1mg。阴性对照试验将供试品溶液，阴性对照溶液（按处方比例称取除牡丹皮外的其他药材同供试品溶液制备条件制备），丹皮酚对照品溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定。（应该得到三个色谱图）结果阴性应无干扰。线性试验 分别精密吸取对照品溶液4、8、12、16、20l,按上述色谱条件,测定峰面积。以色谱峰峰面积（y）为纵坐标,对照品进样量(x)为横坐标,绘制标准曲线并进行线性回归,得回归方程，相关系数r应不低于0.999。精密度试验重复性:分别取同一批供试品,按供试品测定项下方法,重复制备样品6次,进行测定，计算含量平均值，结果用RSD值表示，一般要求RSD3。稳定性试验（考察供试品溶液保存的时间）精密吸取同一供试品溶液10l，注入液相色谱仪，按上色谱条件，间隔不同时间0，0.5h、1h、2h、4h进行测定，计算RSD值（3%）。精密度试验（考察仪器的精密度）精密吸取同一对照品溶液 10 l ，注入液相色谱仪，按上条件进行测定，计算RSD值（3%）。中间精密度试验 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员,用不同设备测定结果之间的精密度，结果用RSD值表示，一般要求RSD3。重复性试验对同一批号样品，按照供试品溶液制备方法制备6次，进行测定，计算RSD值（3%）。耐用性试验液相色谱法典型的变动因素：不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱， 流动相的组成比例的变化，流动相pH值的变化，柱温， 流速，检测波长等。按上述条件对同一批样品进行测定，计算含量和RSD值（3%）。加样回收率试验取已知含量的样品5份，每份约1.5g，置烧杯中，加适量丹皮酚对照品，按照供试品溶液制备方法进行处理样品及测定，计算回收率和RSD值（3%）。样品含量测定取三批样品，各制备5份，按供试品溶液条件进行测定，计算RSD值（3%）。（2） 理化鉴别1. 枸杞子：含枸杞多糖，又含甜菜碱（betaine）、阿托品、天仙子胺；另含玉蜀黍黄素（zeaxanthin）、酸浆红素（physalein）、隐黄质（cryptoxanthin）、东莨菪素 （scopoletin）、胡萝卜素、核黄素、烟酸、维生素B1、 B2及C种子含氨基酸：天冬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸等。供试品溶液制备：取本品（以下“本品”均指杞菊地黄丸）5g，加水35ml，加热煮沸15分钟，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯15ml萃取3次，分取乙酸乙酯液，浓缩至1ml，作为供试品溶液。对照药材溶液制备：另取枸杞子对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除枸杞子外的其他药材同法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法实验：吸取上述三种溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸(3：2：1)为展开剂。展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。或以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15:2:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。2.菊花：含有挥发油约0.13%，菊甙，腺嘌呤，胆碱，水苏碱，微量维生素A样物质，维生素B，氨基酸和刺槐素等供试品溶液制备：取本品5g，加石油醚15ml（具塞锥形瓶），超声处理10分钟，弃去石油醚，药渣挥干，加稀盐酸1ml与乙酸乙酯50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。对照药材溶液制备：另取菊花对照药材粉末1g，同供试品溶液制法制成对照药材溶液。阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除菊花外的其他药材同法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法实验：吸取上述三种溶液各5l，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（2：30：2：2：4）的上层溶液（分液漏斗）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。或吸取上述三种溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（24：8：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液（10ml硫酸+90ml乙醇），在105烘至斑点显色清晰，并对结果进行分析。供试品色谱中，于对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点。3.熟地黄：各种熟地黄的水及醇提取物较生、干地黄多，但各种方法炮制的熟地黄，水或醇提取物相差不大。干地黄中的特有的环烯醚萜及环烯醚萜甙，而熟地中几乎没有。熟地黄中含葡萄糖8.57%，较鲜地黄中含量(1.56%)为高。在干地黄和熟地黄的炮制过程中，甙类成分亦有不同程度的分解，其中以单糖甙分解最多，其次是双糖甙，而三糖甙的地黄宁甙 D(Rehmannioside D)几乎不分解，熟地黄除梓醇(Catalpol)分解不及干地黄外，两者的差异不明显。供试品溶液的制备：取本品6g，研碎。加乙醇30ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇l ml使溶解，作为供试品溶液。对照药材溶液的制备：另取熟地黄对照药材1g，加乙醇15ml，同法制成对照药材溶液。阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除熟地黄外的其他药材，同法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法试验：吸取上述三种溶液各5l，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(6090)：乙酸乙酯(1：1)或氯仿：甲醇(73)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇液，105加热至斑点显色清晰。展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。4.酒萸肉：含有单萜类、脂肪醛、脂肪烃，酸、酯等芳香族化合物，另含有苷类成分，如山茱萸苷、莫罗忍冬苷、7-0-甲基莫罗忍冬苷、獐牙菜苷、番木鳖苷以及鞣质类成分和苹果酸、酒石酸、没食子酸、维生素A。供试品溶液的制备：取本品5g，剪碎，加乙酸乙酯l0ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸于，残渣加无水乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。对照药材溶液的制备：另取酒萸肉对照药材1g，加乙酸乙酯l0ml，同法制成对照药材溶液。阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除酒萸肉外的其他药材同法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法实验：吸取上述三种溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯一乙酸乙酯一甲酸(20：4：0.5)为展开剂（或正丁醇-冰乙酸-水（4:1:5上层）；或三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2下层）展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；置紫外光灯(365nm)下检视，显相同的橙黄色荧光斑点。5.牡丹皮：鲜根含牡丹酚原苷5%6%，但在干燥及贮藏过程中易酶解成牡丹酚苷和一分子阿拉伯糖；另含牡丹酚、芍药苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷及苯甲酰羟基芍药苷、挥发油，以及苯甲酸、植物甾醇、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖等。供试品溶液的制备：取本品6g，研碎，加乙醚40ml，加热回流（40）0.5小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮 l ml使溶解，作为供试品溶液。 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材l g，同法制成对照药材溶液。对照品溶液的制备：另取丹皮酚对照品，加丙酮制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除牡丹皮外的其他药材同法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法实验：吸取上述四种溶液各5l，分别点于同一硅胶 G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯（ 3 : 1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性 5%三氯化铁乙醇溶液（5g三氯化铁溶于100ml乙醇，加少量盐酸调至酸性），加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的条斑。或吸取上述两种溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷一乙酸乙酯一冰醋酸(4：1：0.1) 或环己烷-三氯甲烷-无水乙醇（7:3:1）为展开荆，展开，取出，晾干。喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液（10ml硫酸用乙醇稀释至100ml，将2g香草醛加入，使溶解），在105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。6.山药：含多巴胺、山药碱、槭素、豆固醇、胆甾醇、盐酸山药碱、麦角甾醇、奎宁酸、菜油甾醇、胆固醇、薯蓣皂苷元、尿囊素、菜油固醇、二十六酸、&beta；-谷甾醇；另含游离氨基酸，淀粉、鞣质、粘液质、糖蛋白、多酚氧化酶等成分。供试品溶液的制备：取本品5g，剪碎，加二氯甲烷30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。对照药材溶液的制备：另取山药对照药材5g，同法制成对照药材溶液。阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除山药外的其他药材，同法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法实验：吸取上述三种溶液各4l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯一甲醇一浓氨试液(9：1：0.5) 或氯仿:甲醇:水（6.4:5:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。7.茯苓：含三萜羧酸，有茯苓酸、土莫酸、齿孑L菌、松苓酸、松苓新酸等，还含有多聚糖，主要为茯苓聚糖，含量最高可达75%，经结构改造后可得到具有较强抗肿瘤活性的茯苓次聚糖。此外，尚含有组氨酸、腺嘌呤、胆碱、&beta；-茯苓聚糖酶、蛋白酶、脂肪酸、脂肪、卵磷脂、麦角甾醇、茯苓素等。供试品溶液制备：取本品6g，研碎，加乙醚50ml（具塞锥形瓶），超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。对照品药材制备：取茯苓对照药材1g，同法制成对照药材溶液。阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除茯苓外的其他药材，同法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法实验：吸取上述三种溶液各2l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯一乙酸乙酯一甲酸(20：5：0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。或吸取上述溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯一乙酸乙酯一冰醋酸(24 : 8 : 1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。8.泽泻：含多种四环三萜酮醇衍生物，包括泽泻醇A、泽泻醇B、泽泻醇C及泽泻醇A酸酯、泽泻醇B酸酯、泽泻醇C酸酯等。并含胆碱、卵磷脂和一种磷脂