（精选幻灯片）PCR原理及检测方法解读.ppt

PCR原理及检测方法 1 一 PCR的定义 PCR polymerasechainreaction 聚合酶链式反应 又称体外DNA扩增技术 近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术 2 PCR技术 1985年由美国Cetus公司的KaryMullis首创 可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上 优点 敏感度高 特异性强 产率高 重复性好以及快速简便等 广泛应用于微生物学 考古学 法医学及体育等领域 并已普及到许多普通实验室 大大简化了传统的分子克隆技术 从而比较容易地对目的基因进行分析 鉴定 KaryMullis本人因此获1993年诺贝尔化学奖 3 二 PCR的原理 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段 类似于天然DNA的复制过程 以拟扩增的DNA分子为模板 以一对分别与模板5 末端和3 末端互补的寡核苷酸片段为引物 在DNA聚合酶的作用下 按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成 重复这一过程 即可使目的DNA片段得到扩增 4 扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合 基本反应步骤分三步 1 变性 Denaturation 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链 94 30 2 退火 复性 Annealling 突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合 也存在两条模板链之间的结合 但由于引物的高浓度 结构简单的特点 主要的结合发生在模板与引物之间 55 30 5 3 延伸 Extension 将反应温度调节到酶的最适温度 在DNA聚合酶 4种dNTPs及镁离子等存在的条件下 以引物的3 端开始 结合单核苷酸 形成与模板链互补的新DNA链 72 1 上述3步为一个循环 每经过一个循环 样本中的DNA量应该增加一倍 新形成的链又可成为新一轮循环的模板 经过25 40个循环后DNA可扩增106 109倍 6 7 8 9 PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的 反应初期 原来的DNA担负起使模板的作用 随着循环次数的递增 由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板 最终的扩增产物是介于两种引物5 端之间的DNA片段 10 三 PCR的成分和作用 1 缓冲液 10 50mMTris Cl pH8 4 维持Taq酶作用环境的偏碱性25 50mMKCl促进引物退火 50mM会抑制Taq酶的活性 100 g ml牛血清白蛋白 BSA 对酶有一定的保护性 如质量不好将起相反的作用 建议使用乙酰化的BSA 明胶 Tween 20 二硫苏糖醇 DTT 也有类似作用 11 2 MgCl2 1 5 2 0mMTaq酶具有Mg2 依赖性 显著影响反应的特异性和扩增片段的产量 过量能增加非特异扩增并影响产率 过低则酶活性显著下降 12 3 dNTPs dATP dGTP dCTP dTTP 底物0 02 0 2mMdNTPs可与Mg2 结合 应注意Mg2 浓度与dNTPs浓度之间的关系 Mg2 浓度比dNTPs浓度高0 2 2 5mM 过高 加快反应速度 还可增加碱基的错误掺入率和室验成本 过低 反应速度下降 可提高实验的精确性 13 4 引物 Primer P 预扩增核酸片段两端的已知序列 决定特异性 0 2 1 M偏高 非特异产物扩增及错配 增加引物之间形成引物二聚体 产量降低 偏低 产量降低 14 5 TaqDNA聚合酶 耐高热0 5 5U 100 l1U 25 50 l偏高 引物非特异产物的扩增偏低 产物量降低 15 6 模板DNA Template 最低102 105bpDNA片段 实际用量远远超过此量 用量需在实验中摸索 1 5 l过高 非特异产物增加过低 产量降低7 水 去离子水 补足整个反应体积 16 四 PCR反应体系 各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算 17 五 PCR反应条件优化 1 温度 循环参数 变性温度和时间 保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键 加热90 95 30 60s 再复杂的DNA分子也可变性为单链 根据模板DNA复杂程度 可以调整变性温度和时间 一般情况下选择94 30 可使各种复杂的DNA分子完全变性 温度过高或高温持续时间过长 可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害 18 复性温度和时间 PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合 复性温度的选择 可根据引物的长度和G C含量确定 长度在15 25bp之间时 复性温度Tm 4 G C 2 A T 计算得到 一般位于40 60 30 60s 复性温度越高 产物特异性越高 复性温度越低 产物特异性越低 一般情况下选择55 30 足以使引物与模板之间完全结合 19 延伸温度和时间 一般位于Taq酶最适作用温度70 75 之间 引物小于16个核苷酸时 过高的延伸温度不利于引物与模板的结合 可以缓慢升温到70 75 延伸反应时间 可根据待扩增片段的长度而定 1Kb需加长延伸时间 10Kb片段延伸时间可达15分钟 延伸时间过长可出现非特异扩增 常用72 1 20 循环数 其他参数选定后 PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度 理论上说20 25次循环后 PCR产物的积累即可达到最大值 实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100 因此不管模板浓度是多少 20 30次是比较合理的循环次数 循环次数越多 非特异扩增增加 21 六 PCR扩增产物的分析常用琼脂糖凝胶电泳 上排 1 marker2 阴性对照3 17 标本 引物为CA16 下排 1 3 标本 引物为CA16 4 CA16引物的阳性对照5 marker6 阴性对照7 14 标本 引物为EV71 15 EV71引物的阳性对照 22 RT PCR技术 RT PCR是将RNA的反转录 RT 和cDNA的聚合酶链式扩增 PCR 相结合的技术 首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA 再以cDNA为模板 扩增合成目的片段 作为模板的RNA可以是总RNA mRNA或体外转录的RNA产物 无论使用何种RNA 关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染 RT PCR可以一步法或两步法的形式进行 23 Real TimePCR技术 在实时荧光定量PCR反应中 引入了一种荧光化学物质 随着PCR反应的进行 PCR反应产物不断累计 荧光信号强度也等比例增加 每经过一个循环 收集一个荧光强度信号 这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化 从而得到一条荧光扩增曲线图 24 TaqMan探针是一种寡核苷酸探针 它的荧光与目的序列的扩增相关 它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对 荧光基团连接在探针的5 末端 而淬灭剂则在3 末端 25 当完整的探针与目标序列配对时 荧光基团发射的荧光因与3 端的淬灭剂接近而被淬灭 但在进行延伸反应时 聚合酶的5 外切酶活性将探针进行酶切 使得荧光基团与淬灭剂分离 因而荧光基团发射出荧光信号 随着扩增循环数的增加 释放出来的荧光基团不断积累 因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系 26 一般而言 荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段 荧光背景信号阶段 荧光信号指数扩增阶段和平台期 在荧光背景信号阶段 扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖 我们无法判断产物量的变化 而在平台期 扩增产物已不再呈指数级的增加 PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系 所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数 只有在荧光信号指数扩增阶段 PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系 我们可以选择在这个阶段进行定量分析 27 为了定量和比较的方便 在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念 荧光阈值和CT值 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值 它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上 但一般我们将荧光域值的缺省设置是3 15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值 thresholdvalue 28 29 30 PCR检测对标本采集及保存 运输的要求 咽拭子 粪便 疱疹液 脑脊液等 用于病毒分离和核酸检测的标本尽早采集 病毒储存液保存 冷链运输 尽快送至实验室进行检测 20 长期保存 但是流感样病例标本应于 70 长期保存 31 新型甲型H1N1流感检测 32 核酸提取 使用试剂 核酸提取试剂盒QIAGENRNeasyminikit 74104 预冷的70 乙醇溶液 无RNase水配制 自备 巯基乙醇 自备 基本步骤 裂解组织 释放核酸 除去蛋白杂质 最后获得核酸产物 33 注意事项 1提取核酸过程中使用的所有溶液和耗材必须经过特殊处理 确保无RNase2操作过程中必须尽量保持低温 迅速3操作要在生物安全柜中进行 检测标本样品和试剂必须在生物安全柜中才可以打开操作中必须做好防护 防止降解 污染和感染 4提取好的核酸若不立即进行检测 应于 20 保存 34 RT PCR检测 1 反应体系配制 25ul体系 在专门的生物安全柜中进行 使用试剂盒 QIAGENonestepRT PCRkit 210212 RNasefreewater11 9ul5 RT PCR缓冲液5ul10mMdNTP1ulEnzymix1ulRNasin0 1ul上游引物 20uM 0 5ul下游引物 20uM 0 5ul合计20ul 35 对每一个建立的反应确定反应数 n 拟进行的PCR管数 包括阴性 阳性对 考虑到阴性无模板对照 阳性对照 误差 制备过量的反应混合物是必要的 具体如下 1 如果包括对照 样品的数量 n 为1到14 那么N n 1 2 如果包括对照 样品的数量 n 大于15 那么N n 2 2 将上述反应液混匀 分装到0 2mLPCR小管中 每管20 L 分别做好标记 3 加RNA模板 在核酸提取区 将上述分装好的PCR小管分别加入模板 首先加入阴性对照管 5 L无菌水 然后分别加标本RNA 每管5 L 最后加入阳性对照RNA 每管5 L 36 反应条件 1 60 1分钟2 42 10分钟3 50 30分钟4 95 15分钟5 94 30秒6 50 30秒7 72 1分钟回到第5步40个循环8 72 10分钟9 end 37 电泳并观察结果 提前用1 的TBE缓冲液配制1 5 2 Agrorosegel 胶块凝固后将其放置在加有1 TBE缓冲液的电泳槽中 电泳缓冲液必须淹没胶块 电泳液最好新鲜配制 PCR结束后 各取5ulPCR产物和1ul6 LoddingBuffer混匀 点样 同时加DL2000Marker5ul 阴 阳性对照 电泳电压 120V时间 胶块的体积和浓度都对电泳时间有影响 一般30min 1h 根据LoddingBuffer中的溴芬兰指示剂的位置来判断电泳的程度 一般蓝色指示条带泳动到胶块2 3位置处 就可以观察结果了 38 39 40 Real timePCR检测 体系的配制 25ul体系 RNasefreewater5 75ul2 MasterMix12 5ulRT Mix0 25ulPrimer 1 40uM 0 5ulPrimer 2 40uM 0 5ulProbe 10uM 0 5ul上述成分混匀 每管加入5ul待检样品的核酸 封盖 上机 样品多时 同RT PCR体系的配制方法 混匀分装 必须同时设定阴 阳性对照和空白对照 41 42 反应条件 1 60 5min2 50 30min3 95 15min4 95 15s5 55 30s6 72 30s7 readplate8 gotostep4 for45cycles9 72 5min10 readplate11 end 43 44 注意事项 RT PCR引物稀释方法 工作浓度 20 M 配制方法 1 10 储存液配制 1 将新合成的引物在开盖前短暂离心 12000rpm 15s 2 用RNaseFreeWater溶解 加水量为10 总摩尔数 充分混匀 此时引物浓度为100pmol L 即100 M 2 引物使用浓度配制 将100 M的引物浓度再5倍稀释 配成浓度为20 M 即可直接用于PCR反应 请注意各引物管实际所标记的OD数 45 Real timePCR检测引物和探针稀释方法1 引物工作浓度 40 M 配制方法 1 将新合成的引物开盖前短暂离心 12000rpm 15s 2 用RNaseFreeWater溶解 加水量为10 总摩尔数 充分混匀 此时引物浓度为100 M 可作为储存液 例如 假设合成引物每管2OD 若1OD的量为4 75nmol 0 00475 mol 则一管引物的总摩尔数为2 4 75 9 5nmol 加水量为10 9 5 95 l 3 将100 M的引物2 5倍稀释 此时浓度为40 M 可作为工作浓度 2 探针工作浓度 10 M 配制方法 1 将新合成的探针管开盖前短暂离心 12000rpm 15s 2 用RNaseFreeWater溶解 加水量为10 总摩尔数 充分混匀 此时引物浓度为100 M 可作为储存液 3 将100 M的探针10倍稀释 此时浓度为10 M 可作为工作浓度 46 引物 探针稀释后 20 保存阳性对照RNA收到后分装成若干管 置 20 或以下保存在试验过程中 保持所有的试剂在冰架上保持低温 使用的试剂必须从冷冻状态彻底融化混匀后使用 1 分装好的冰冻的引物和探针进行融化 已融的探针避光2 8 可保存多达3个月 不要对探针反复冻融 2 涡旋振荡引物和探针 3 瞬时离心引物和探针 之后置于冰架上 47 材料及仪器 48 1 RNA提取试剂盒QIAGenRNeasyMiniKit catalog 74104 2 巯基乙醇 SIGMA MercaptoethanolLot062K0115 3 70 乙醇4 RT PCRKit QIAGENOnestepRT PCRKit catalog 210212 QIAGENquanteticprobeRT PCRkit catalog 204443 5 RNasinRibonucleaseI