实验二：淀粉酶活性测定实验报告.doc

. 淀粉酶活性的测定一、实验目的酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到。淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。-淀粉酶是一种典型的内切型淀粉酶,主要作用于淀粉水解的液化阶段,因此又叫液化酶。作为一种最重要的工业酶制剂，-淀粉酶广泛存在于动物,植物和微生物中。其中，微生物-淀粉酶以其经济易得成为工业生产主要来源。目前,关于-淀粉酶活性的测定方法很多种。 本实验采用杨氏改良法测定-淀粉酶；掌握测定-淀粉酶活性大小与温度关系的方法，通过分析得出酶的最适温度范围。二、实验原理酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和pH值称为某种酶作用时的最适温度和pH值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低，其变化趋势呈钟形曲线变化。 不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称-淀粉酶为液化淀粉酶。-淀粉酶不能水解淀粉支链的-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和-1,6键的寡糖。 本实验通过淀粉遇碘显蓝色，淀粉含量越高，颜色越深。用分管光度计检测显色效应大小，通过分管光度值计算酶活力注意：实验中为了消除非酶促反应引起的淀粉水解带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。并且在酶的作用过程中，三支测定管及空白管不要混淆。三、材料、试剂与仪器实验材料：-淀粉酶仪器：分光光度计、电热恒温水浴锅、小台秤、研钵、玻璃仪器若干试剂： 0.4M NaOH/0.4M CH3COOH及0.1M HCl： 0.005%工作碘液：0.5克I2和5.0克KI水中研磨，定容至1000mL； 1%糊化淀粉溶液：称取1.0克淀粉，加入25mL0.4M NaOH，605min，冷却后加25mL0.4M CH3COOH，定容至100mL； 稀释-淀粉酶溶液：待测样品 四、实验步骤 10mL1%淀粉溶液加入试管中，室温25/45/65保温10min于每管中各加酶稀释液1mL，在室温25/45/65恒温水浴中（水浴温度的变化不应超过0.5）准确加热10min，冷却。加1mL1M盐酸终止反应。 取上述混合液1mL加入预先装好10mL工作碘液的试管，摇匀。 660nm测吸光度（蒸馏水调零），记录数据。（注：吸光度测定勿漏空白对照组）对照组为不加酶液，加相应体积的水五、数据整理及计算温度（）254565OD660对照组OD0660 根据以上的数据整理的结果，结合以下公式计算两种淀粉酶的活性：酶活=(D0-D)*100/D0*10*稀释倍数D反应混合液吸光度D0对照组吸光度100系数(%)10反应时间酶