课题3　分解纤维素的微生物的分离.ppt

课题3 分解纤维素的微生物的分离 专题二微生物的培养与应用 知识与技能简述纤维素酶的种类及作用 从土壤中分离出分解纤维素的微生物 掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术 过程与方法分析分离分解纤维素的微生物的实验流程 弄懂实验操作的原理 情感 态度与价值观领悟科学探究的方法 发展科学思维和创新能力 学习目标 纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物 是含量最丰富的多糖类物质 植物的根 茎 叶等器官都含有大量的纤维素 纤维素能被土壤中某些微生物分解利用 这是因为它们能够产生纤维素酶 导入新课 阅读课本27页基础知识部分第一 二段 回答下列问题 1 纤维素在生物圈的分布状况 一 纤维素和纤维素酶 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物 其纤维素的质量分数可达92 95 亚麻 木材 作物秸秆等也富含纤维素 许多商品纤维素都是由天然纤维素制得的 用分解纤维素的微生物处理后 纤维素可分解成糖 它不仅可以供给人们能量 还可以用于酿酒 酿醋等食品加工业 成为葡萄糖的替代品 2 纤维素酶的组成及作用 纤维素酶是一种 一般认为它至少包括三种组分 即 和 前两种酶使纤维素分解成纤维二糖 第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖 复合酶 C1酶 CX酶 葡萄糖苷酶 滤纸崩溃法 纤维素酶活性的测定实验 在2支20mL的试管中 分别放入1 6cm的滤纸条 再分别加入pH为4 8 物质的量浓度为0 1mol L的醋酸 醋酸钠缓冲液10mL 11mL 在加入10mL缓冲液的试管中加入1mL纤维素酶 70 80U mL 将二支试管固定在50mL的锥形瓶中 在摇床上以140r min的转速振荡反应1h 观察结果 1U表示1个酶活力单位 是指在温度为25 其他反应条件 如pH等 均为最适的情况下 在1min内转化1mmol的底物所需的酶量 底物 酶所作用和催化的化合物 在一支试管中添加纤维素酶 另一支试管不添加纤维素酶 尽管醋酸 醋酸钠缓冲液用量不同 但都能维持相同的pH 思考1 实验分析 P27的小实验是如何构成对照的 二 纤维素分解菌的筛选 阅读课本课本28页相关部分 回答下列问题 1 纤维素分解菌的筛选方法 2 纤维素分解菌的筛选方法的原理 刚果红染色法 这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选 可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌 练一练 1 下列关于纤维素酶的说法 错误的是 A 纤维素酶是一种复合酶 至少包括三种B 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖 2 利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌 下列说法错误的是 A 刚果红能与纤维素形成红色复合物B 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物C 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D 若培养基上产生了透明圈 则说明已筛选出了纤维素分解菌 温故知新 三 实验操作 土壤取样 选择培养 梯度稀释 将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 挑选产生透明圈的菌落 教材P28 旁栏思考题 本实验流程与课题2的流程的区别为 课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上 直接分离得到菌落 本课题通过选择培养 使纤维素分解菌得到增殖后 再将菌液涂布在选择培养基上 其他步骤基本一致 一 土壤取样 取样的环境是怎样的 作出这种选择的理由是什么 选择纤维素丰富的环境 如树林中多年落叶形成的腐殖土 多年积累的枯枝败叶等等 生物与环境的互相依存关系 在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高 因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境 在富含纤维素 潮湿的土壤中 用无菌小铁铲铲去表层土 迅速铲取土壤并装入无菌信封 密封 旁栏思考题 2 由于生物与环境的相互依存关系 在富含纤维素的环境中 纤维素分解菌的含量相对提高 因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境 3 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集 实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境 一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中 二 选择培养 1 选择培养的目的 增加纤维素分解菌的浓度 以确保能够从样品中分离到所需要的微生物 2 制备选择培养基 参照课本29页旁栏中的比例配置 回答下列问题 a 旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基 为什么 b 这个培养基对微生物是否具有选择作用 如果具有 是如何进行选择的 c 你能否设计一个对照实验 说明选择培养基的作用 是液体培养基 原因是配方中无凝固剂 有选择作用 本配方中的碳源是纤维素 所以能分解纤维素的微生物可以大量繁殖 用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照 3 具体操作 称取土样 无菌条件下加入装有30mL选择培养基的锥形瓶 锥形瓶固定在摇床上 一定温度下振荡培养1 2d培养液变混浊 吸取一定量培养液如 5mL 转移至另一瓶新鲜的选择培养基中 摇床上振荡培养 培养液变混浊 思考 为什么选择培养能够 浓缩 所需的微生物 在选择培养的条件下 可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖 而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制 因此可以起到 浓缩 的作用 三 梯度稀释 按照课题1的稀释操作方法 将选择培养后的培养基进行等比稀释 稀释最大倍数到106 用1mL无菌吸管从选择培养其中吸取1mL培养液注入盛有9mL无菌水的试管中 吹吸三次 使充分混匀 再用一支1mL无菌吸管从此试管中吸取1mL菌液注入另一支盛有9mL无菌水的试管中 以此类推配制成101 102 103 104 105 106倍的各种稀释液 四 将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 1 制备培养基 参照旁栏中的比例2 涂布平板 将稀释度为104 106的菌悬液各取0 1ml涂布在培养基上 30 倒置培养 鉴别纤维素分解菌的培养基 水溶性羧甲基纤维素钠 涂布培养具体操作 将鉴别培养基三个平板分别用记号笔写上104 105 106倍的三种稀释度 另取三个不含纤维素的培养基平板 分别用记号笔写上104 105 106倍的三种稀释度 然后用三支1mL无菌吸管分别由104 105 106倍的三管稀释液中吸取0 1mL对号滴入已写好稀释度的平板上 用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀 将培养基平板倒置于30 37 温室中培养1 2d 每隔24h观察菌落情况 特别提示 在实验操作中 土壤取样 选择培养 梯度稀释 涂布等步骤都需注意无菌操作 五 挑选产生透明圈的菌落 参照课本刚果红染色法 挑选产生透明圈的菌落 一般即为分解纤维素的菌落 刚果红染色法 方法一 先培养微生物 再加入刚果红进行颜色反应 方法二 在倒平板时就加入刚果红 思考 这两种方法各有哪些优点与不足 方法一缺点是操作烦琐 加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂 优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用方法二优点是操作简便 不存在菌落混杂问题缺点一是由于培养基中还含有淀粉类物质 可以使能产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应 缺点二有些微生物具有降解色素的能力 它们在长时间培养过程中会降解刚果红 形成明显的透明圈 与纤维素分解菌不易区分 小结 练一练 1 在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌 符合下列哪一生物学观点 A 生物结构与功能相适应的观点B 生物结构与功能整体性观点C 生物与环境相适应的观点D 生物发展进化的观点 2 从土壤中分离获得某种微生物的步骤是 土壤取样 梯度稀释 选择培养 菌悬液涂布平板 挑选出单个菌落A B C D 3 有关选择培养正确的叙述是 A 可以增加纤维素分解菌的浓度B 可以减少纤维素分解菌的浓度C 所用培养基是固体培养基D 所用培养基是平板培养基 C B A 四 结果分析与评价 一 培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落 二 分离的结果是否一致 设置对照 若对照的培养基在培养过程中无菌落生长则说明培养基制作合格 如果观察到产生透明圈的菌落 则说明可能获得了分解纤维素的微生物 如果不同 分析产生不同结果的原因 为了确定分离得到的是纤维素分解菌 还需要进行 实验 纤维素酶的发酵方法有 发酵和 发酵 纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 含量进行定量测定 发酵产纤维素酶 液体 固体 葡萄糖 五 课题延伸 小结 1 纤维素酶的应用纤维素酶可以作为畜禽饮料添加剂 其作用机制在于它可破坏植物细胞壁 使胞内原生质暴露出来 由内源酶进一步降解 所以除了细胞壁被降解供能外 还提高了胞内物质的消化率 从而有效地提高了饮料的有效能值 2 分离纤维素分解菌的几个关键步骤为 分离纤维素分解菌的实验中先用选择培养基 再用鉴别培养基 选择培养基为液体培养基 以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长 而其他绝大多数微生物不能正常生长 因培养基中无凝固剂 为液体培养基 利用液体培养基能使营养成分充分消耗 以增加纤维素分解菌的浓度 鉴别培养基含琼脂 为固体培养基 因为要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落 刚果红染色法就是应用的此培养基 3 对照实验的设置 判断某个培养基是否具有选择作用时 应设立基础培养基进行对照 本实验方案中应设置普通培养基 或牛肉膏蛋白胨培养基 作为对照实验 分离纤维分解菌先进行选择培养 其目的是增加纤维素分解菌的浓度 然后经梯度稀释后 再涂布到鉴别培养基上 判断所使用的培养基是否被杂菌污染时 应设立不接该菌种的培养基进行空白对照 4 鉴别培养基利用细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同 在培养基中加入特定的作用底物和指示剂 观察细菌生长过程中分解底物所释放的不同产物 通过指示剂的反应不同来鉴别细菌 本实验中的培养基加入刚果红 可鉴别纤维素分解菌 如在培养基中加入伊红 美蓝 可鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌 若有 菌落呈现黑色 并带有金属光泽 5 知识框架 染色鉴别 纯化培养 纤维素分解菌能够产生纤维素酶分解纤维素 回答下列问题 1 在培养纤维素分解菌的过程中 进行平板划线时 每次划线结束后仍然要灼烧接种环 原因是 2 在筛选纤维素分解菌的过程中 通常用 染色法 这种方法能够通过颜色反应直接对纤维素分解菌进行筛选 甲同学在实验时得到了如图所示的结果 则纤维素分解菌位于 及时杀死接种环上残留的菌种 避免细菌污染环境或感染实验操作者 刚果红 A B C D 3 乙同学打算从牛胃中分离纤维素分解菌并计数 与分离醋酸菌相比 进行培养时除了营养不同外 最主要的实验条件差别是 该同学采用活菌计数法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目 A 保证无氧环境 小 低 4 丙同学在提取和分离纤维素酶的过程中 为了抵制外界酸和碱对酶活性的影响 采取的措施是向提取液和分离液中添加 若探究纤维素酶活性的最适温度 如何设置对照 缓冲