RT-PCR操作步骤.doc

RT-PCR操作步骤（2008/11/7整理，ZLJ）原理：Trizol是由酚与异硫氰酸胍组成的均相溶液，酚起到变性的作用，使蛋白变性，异硫氰酸胍可以抑制RNA酶，防止RNA的降解。（一） 试剂准备1 Trizol试剂2 氯仿、异丙醇、无水乙醇（国产色谱纯）3 三蒸水（娃哈哈）4 75%乙醇（DEPC H2O配制） (用于擦枪等) 0.1%DEPC H2O配制。无水乙醇500mL,倒出200ml，加入100ml的0.1%DEPC H2O。 （用于RNA洗涤）0.01%DEPC H2O配制。无水乙醇500mL,倒出200ml，加入100ml的0.01%DEPC H2O。5 DEPC H2O 0.1%DEPC H2O(用于处理枪、枪头盒)。用三蒸水配制。加入体积0.1%的DEPC 0.01%DEPC H2O (用于RNA提取最后一步)三蒸水配制,加入体积0.01%的DEPC.盖上胶塞,过夜,高压灭菌.6 PBS配制100ml，专门用于该实验。7 TE缓冲液8 反转录试剂盒（MBI）9 Taq 酶 耐热DNA聚合酶（Takara Japen）10 dNTPs (Takara Japen)11 溴酚兰12 Marker（二） 耗材准备1 Rnase-free塑料EP管。直接使用。2 一次性PE手套（3包）3 三种规格枪头 处理：枪头及枪头盒，镊子、及4ml国产EP管放入饭盒中，加入0.1%DEPC H2O，浸入后，盖厚纱布，将处理的物品压入水中，盖上饭盒盖，自封袋封好，室温过液。烘干。灭菌30分钟。 （三） RNA提取一步法提取细胞总RNA准备试管架、1.5ml EP管架、2套1.5mLEP管、4mL处理过的EP管（数目同样品数）所有EP管标号1 收获细胞，移入4mL离心管（处理过）中，1000转离心5min，PBS洗一遍。2 每加入1ml Trizol, 枪头反复吹打，移入1.5mLEP管中，室温静置5min。不能随意增加样品量或减少Trizol 量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。3 加氯仿200微升，盖好，剧烈震荡15秒。室温放置2-3分钟，412000g离心15分钟。4 仔细吸取上层水相（约500L,枪调到170L，吸三次），移到另一套1.5mLEP管中。5 加500微升异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min.6 4离心，12000g，10min, 弃上清。7 加入1ml 75%乙醇（0.01%DEPC处理过的），轻轻洗涤沉淀。4, 7500g, 离心5min。尽可能吸走上清液8 室温下挥干（5-10分钟），注意不能完全干燥。加0.01%DEPC H2O 40L, 吹打溶解，56水浴助溶10分钟。-70冰箱保存。（四） 紫外吸收测定法分析RNA浓度、纯度RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40g/ml的单链RNA。如用1cm光径，用DEPC H2O稀释DNA样品n倍并以DEPC H2O 为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品翻译前的浓度。操作步骤：用DEPC H2O种类稀释RNA（稀释600倍），即吸收10LRNA，加入TE溶液1990，稀释200倍，读取其在分光光度260nm 和280nm 处的吸收值，以DEPC H2O调零。样品RNA浓度（g/ml）计算公式为：A260稀释倍数40g/mL，根据RNA浓度测定的结果将总RNA配制成1g/ml。（A260*8g/L）用0.01%DEPC水稀释成1g/L的样品RNA浓度RNA溶液的A260/A280的比值检测RNA纯度，比值范围应在1.8-2.1之间。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。（五） RT合成cDNA第一链（按照试剂盒操作说明进行，MBI）1 取样品总RNA 2L随机引物 1L加DEPC H2O（9L）到总体积12L离心3-5秒（掌上离心机）2 65，5分钟；0 forever离心3-5秒 3冰上操作 （以下事先混合好，分别加入各种样品中8L） 加入5reaction buffer 4L RibonLockTMRibonuclease inhibitor 1L 10mM dNTP mix 2L RevertAidTMM-MuL V Reverse Transcripase 1L 6. 25 5分钟，42 60分钟 770 5分钟， 4 forever。CDNA储存在-20冰箱里。（六） PCR 反应及检测PCR扩增反应体系25L：（按照顺序加入PCR管中）1st strand cDNA 1L以下配好后，一起加入24微升10PCR Buffer 2.5LdNTP mix 2L (2.5mM2L)引物（含目的基因及DAPDH上、下游引物10pmol）1L（80微升0.01%DEPC,上下游引物分别加10微升）Taq DNA polymerase 1.25units 加入0.25微升三蒸水补足至25L（18.25微升0.01%DEPC）取出后暂放4冰箱保存。摸索条件：如果条带拖尾，应增加退火温度；没有条带是，降低退火温度。可设定梯度升温程序，摸索哪个温度最适合。（七） 琼脂糖凝胶电泳及半定量分析配胶：称0.6克琼脂糖，加50毫升DPE水（稍微多一些，因加热时水分会蒸发，待胶澄清透明，晃动后从底下产生气泡，恰好）。等胶不烫手时加EB 2.5微升。放好梳子，倒胶，赶气泡，40分钟后，拔梳子。将胶放到电泳缓冲液中，上样，跑电泳，90V 20分钟。紫外灯下拍照。取PCR扩增产物5L，加入溴酚蓝1L，于含0。5g/ml 溴化乙啶（EB）的1.2%琼脂糖凝胶电泳，扩增条带与标准DNA分子量条带比较。Quantity One software分析、读取目的基因和GAPDH条带的光密度值，通过计算IOD（目的基因）/IOD（GAPDH）的比值，从而得到目的基因的相对表达丰度。 （三）注意事项1样品量和Trizol加入量一定要按照步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。2. 实验过程中必须严格防止RNase的污染。知识补充：焦碳酸二乙酯（DEPC）：DEPC即diethypyrocarbonate， DEPC结构式中文名为焦碳酸二乙酯。分子式为C6H10O5