AMD3100联合地塞米松对造血干细胞的动员作用.doc

www.CRTER.org燕备战，等. AMD3100联合地塞米松对造血干细胞的动员作用AMD3100联合地塞米松对造血干细胞的动员作用燕备战，马会敏，孔存权，梁 玉，朱伟彦，蒋舒婷(河南省人民医院输血科，郑州大学人民医院输血科，河南省郑州市 450003)引用本文：燕备战，马会敏，孔存权，梁玉，朱伟彦，蒋舒婷. AMD3100联合地塞米松对造血干细胞的动员作用J.中国组织工程研究，2016，20(36):5351-5357.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.005 ORCID: 0000-0001-5923-7932(燕备战)文章快速阅读：AMD3100与地塞米松联合动员造血干细胞从骨髓向外周血迁移燕备战，男，1969年生，河南省新安县人，汉族，2014年郑州大学毕业，硕士，副主任技师，主要从事临床输血方面的研究。中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)36-05351-07稿件接受：2016-07-12AMD3100或地塞米松能够动员造血干细胞从骨髓向外周血迁移，两者联合应用对小鼠造血干细胞动员效果优于单一药物(1)对照组(2)AMD3100组(3)地塞米松组(4)AMD3100+地塞米松组随机分为4组C57BL/6小鼠60只检测CD34+细胞、白细胞含量，集落形成能力文题释义：造血干细胞：通俗地讲，造血干细胞是指尚未发育成熟的细胞，是所有造血细胞和免疫细胞的起源，它不仅可以分化为红细胞、白细胞和血小板，还可跨系统分化为各种组织器官的细胞，具有自我更新、多向分化和归巢(即定向迁移至造血组织器官)潜能。因此是多功能干细胞，医学上称其为“万用细胞”，也是人体的始祖细胞。造血干细胞移植：是指将异体或自体的造血干细胞移植到体内，担负起造血作用，包括红细胞系统、白细胞系统、巨核细胞系统及免疫功能的重建。由于多能造血干细胞存在于骨髓、外周血、胎肝、脐带(包括胎盘)等组织中，因此造血干细胞也包含在广义的“骨髓移植”中，国际骨髓移植登记处、欧洲骨髓移植协作组(EBMT)及亚太骨髓移植协作组(APBHTG)均以骨髓移植命名，包括上述造血干细胞移植的内容。摘要背景：正常状态下外周血中的干细胞数量很低，将供者骨髓中的造血干细胞动员到外周血是造血干细胞移植的关键。目的：探索AMD3100和地塞米松联合用药对小鼠造血干细胞的动员效果，为临床应用奠定基础。方法：选用C57BL/6小鼠，单独或者联合注射AMD3100和地塞米松后采集外周血和骨髓造血干细胞，使用流式细胞仪鉴定外周血和骨髓中CD34+细胞的含量，常规方法计数外周血白细胞含量，集落形成实验计数外周血和骨髓中造血干细胞粒-巨噬细胞混合集落形成单位。结果与结论：AMD3100和地塞米松均可刺激外周血和骨髓中CD34+细胞含量上升，分别在4 h和 2 h时达到高峰，当联合使用AMD3100和地塞米松时，外周血和骨髓中CD34+细胞含量上升幅度最大；AMD3100或地塞米松均可刺激外周血中白细胞含量上升，AMD3100和地塞米松联合动员的外周血白细胞含量高于其他组；AMD3100动员后外周血和骨髓中造血干细胞粒-巨噬细胞混合集落形成数量显著高于对照组，AMD3100和地塞米松联合动员的外周血和骨髓中造血干细胞粒-巨噬细胞混合集落形成数高于单用AMD3100或地塞米松动员组；AMD3100或地塞米松能够动员造血干细胞从骨髓向外周血迁移，两者联合应用对小鼠造血干细胞动员效果优于单一药物。关键词：干细胞；造血干细胞；地塞米松；AMD3100；造血干细胞移植；动员主题词：造血干细胞移植；地塞米松；造血干细胞动员；组织工程基金资助：河南省科技攻关项目(142102310126)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 Combination effect of AMD3100 and dexamethasone on the mobilization of hematopoietic stem cellsYan Bei-zhan, Ma Hui-min, Kong Cun-quan, Liang Yu, Zhu Wei-yan, Jiang Shu-ting (Department of Blood Transfusion, Henan Provincial Peoples Hospital and Peoples Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450003, Henan Province, China)AbstractBACKGROUND: The number of hematopoietic stem cells in the peripheral blood is very low at normal physiological state. So it is critical to mobilize hematopoietic stem cells from donors bone marrow into the peripheral blood. OBJECTIVE: To study the combination effect of AMD3100 and dexamethasone on the mobilization of hematopoietic stem cells in mice, thereby laying the foundation for clinical application.METHODS: C57BL/6 mice were injected with AMD3100 and dexamethasone alone or in combination. Then, hematopoietic stem cells in the peripheral blood and bone marrow were collected. CD34+ cell concentration in the peripheral blood and bone marrow was determined by flow cytometer and the content of leucocytes in the peripheral blood was counted by a normal method. The CFU-Mix colony formation ability of hematopoietic stem cells was identified by cell colony forming assay.RESULTS AND CONCLUSION: The concentration of CD34+ cells in the peripheral blood and bone marrow, the content of leukocytes in the peripheral blood and the CFU-Mix colony formation ability of hematopoietic stem cells were all improved by both AMD3100 and dexamethasone and especially their combined use. This indicates that both AMD3100 and dexamethasone could mobilize hematopoietic stem cells to migrate from the bone marrow to the peripheral blood, and when used in combination, the mobilization effect is better than that of single drug.Subject headings: Hematopoietic Stem Cell Transplantation; Dexamethasone; Hematopoietic Stem Cell Mobilization; Tissue EngineeringFunding: the Scientific Tackle Key Project of Henan Province, China, No. 142102310126Cite this article: Yan BZ, Ma HM, Kong CQ, Liang Y, Zhu WY, Jiang ST. Combination effect of AMD3100 and dexamethasone on the mobilization of hematopoietic stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(36):5351-5357.Yan Bei-zhan, Master, Associate chief technician, Department of Blood Transfusion, Henan Provincial Peoples Hospital and Peoples Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450003, Henan Province, China5353ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction造血干细胞是从血液或骨髓中分离出来的具有高度自我更新和分化潜能的细胞，能够分化成所有类型的血细胞。研究发现，造血干细胞可以横向分化成其他类型的细胞，如肝细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、上皮细胞、神经细胞等1，为多种疾病的治疗开辟了广阔的前景。造血干细胞移植是治疗血液和骨髓疾病的重要手段，如治疗白血病、淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、骨髓增生异常综合征等2。按造血干细胞的来源可分为骨髓移植、外周血干细胞移植和脐血干细胞移植。与其他方法相比，外周血来源造血干细胞收集时对供者创伤较小，在临床上受到广泛的重视。在正常生理状态下，外周血液中的干细胞数量很低，如何将供者骨髓中的造血干细胞动员到外周血是进行造血干细胞移植的关键。临床常利用一些细胞因子、趋化因子、小分子抑制剂等动员剂将造血干细胞从骨髓中释放出来3，使外周血中的造血干细胞数量增加，从而在外周血中采集到足够数量的造血干细胞。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是最常用的造血干细胞动员剂，但是该药作用时间短、价格昂贵，不利于造血干细胞的采集4。单用粒细胞集落刺激因子，临床上仍有大约35%的患者不能动员出足够的造血干细胞5，寻找其他有效的造血干细胞动员方法，具有重要的科研价值和临床应用前景。基质细胞衍生因子1(SDF-1)和CXC趋化因子受体4(CXCR4)分别属于趋化因子CXC亚家族和CTXR类G蛋白偶联受体超家族。SDF-1/CXCR4在机体的免疫调节、炎症反应、中枢神经系统发育和肿瘤迁移中起着重要的作用6。它们可以调控多种信号通路从而影响细胞的生物学过程。研究证实SDF-1/CXCR4可以上调survivin从而调控ERK及PI3K/Akt信号通路，进而影响细胞周期7；SDF-1/CXCR4也可以影响Rac1/ERK、JNK信号通路从而促进生长因子的表达8；抑制CXCR4可以影响Wnt/-catenin信号通路9-10。SDF-1/CXCR4也是造血干细胞动员、迁移、归巢的关键因素11。CXCR4高表达于骨髓的造血干/祖细胞，SDF-1表达于成骨细胞、内皮细胞以及骨髓基质细胞12，表达CXCR4的造血干/祖细胞沿着SDF-1浓度梯度实现归巢13。AMD3100在临床上有广泛的应用，它对造血干细胞的动员机制已基本阐明。当使用AMD3100阻断SDF-1/CXCR4信号通路时，骨髓中高表达的SDF-1对造血干/祖细胞失去趋化性，造血干/祖细胞无法顺着SDF-1浓度梯度迁移至骨髓，更多的停留在外周血中，从而促进了造血干细胞的动员14。普通方法动员失败的人群，可利用AMD3100成功动员15-17。AMD3100分别在2008年和2009年被美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)18和欧洲药品管理局 (European Medicines Agency，EMA)19作为细胞动员剂上市，与粒细胞集落刺激因子联用治疗骨髓瘤和淋巴瘤。地塞米松是糖皮质激素类药物，常用来促进造血干细胞的动员。研究表明，外周血造血干细胞采集3 h前静脉滴注地塞米松10 mg，可以促进骨髓中的造血干细胞释放到外周血中20。地塞米松和其他药物联合作用，可促进造血干细胞的动员。与地塞米松联用的药物有沙利度胺21、粒细胞集落刺激因子22-24、环磷酰胺25、硼替佐米等26。地塞米松和糖基化的粒细胞集落刺激因子联合应用，可缩短不良反应的时间27。实验以C57BL/6小鼠为模型，探索AMD3100和地塞米松联合作用对小鼠造血干细胞动员的效果，为临床应用奠定了基础。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 细胞分子生物学体内实验。1.2 时间及地点 实验于2014年8月至2015年5月在河南省人民医院病理科完成。1.3 材料 SPF级C57BL/6小鼠60只，8-12周龄，雌雄各半，体质量18-24 g，购自中科院上海实验动物中心。AMD3100、地塞米松、甲基纤维素购自Sigma公司；Ficoll-Hypague、Ficoll-Paque Plus淋巴细胞分离液购自美国GE公司；IMDM培养液购自HyClone公司；牛血清白蛋白、胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素、链霉素购自Gibco公司。1.4 实验方法1.4.1 分组给药方法 60只C57BL/6小鼠随机分为4组：对照组、AMD3100组、地塞米松组、AMD3100+地塞米松组，每组15只。依次按AMD3100 5 mg/kg，地塞米松0.2 mg/kg的剂量皮下注射，对照组注射等体积的生理盐水。注射后0，2，4，8，12 h采集外周血和骨髓血，每个时间点3只。1.4.2 外周血造血干细胞采集 小鼠自眼眶静脉丛采血，置于抗凝管中，采用Ficoll-Hypague密度梯度离心获取外周血单个核细胞，PBS洗涤2次，制成外周血单个核细胞悬液。1.4.3 骨髓造血干细胞的采集 采外周血后即刻颈椎脱臼处死小鼠，将小鼠浸泡于体积分数为75%乙醇中消毒1 min，无菌条件下取股骨，尽量去除表面的附着组织，2 mL IMDM冲出骨髓细胞，用枪头反复吹打成细胞悬液，用70 m孔径的过滤器滤除其中的凝集物，Ficoll-Paque Plus淋巴细胞分离液分离单个核细胞。 4 ，1 000g离心5 min，制备成单个核细胞悬液。以1109 L-1的细胞浓度接种于含体积分数为10%胎牛血清的IMDM培养基(含青、链霉素各100 U/mL)中，置于37 ，体积分数为5% CO2培养箱，培养48 h后收集非贴壁的悬浮细胞。1.4.4 外周血和骨髓造血干细胞表型CD34的检测 吸取200 L细胞悬液，分为2组，一组加入FITC标记的大鼠抗小鼠CD34抗体，另一组加入FITC标记的大鼠IgG2a作为对照，室温避光孵育20 min，流式细胞仪检测CD34+细胞百分比。1.4.5 外周血白细胞计数 取5 L外周血加入195 L 2%醋酸溶液中，混匀后利用细胞计数板在显微镜下进行白细胞计数。1.4.6 外周血和骨髓造血干细胞集落形成的检测 将细胞悬液以1108 L-1的细胞浓度接种于半固体培养基中，培养基的成分为1.2%甲基纤维素、0.1 g/mL去离子牛血清白蛋白、胎牛血清、3%谷氨酰胺、IMDM培养液。在37 ，体积分数为5% CO2条件下培养14 d计数粒-巨噬细胞混合集落形成单位(CFU-Mix)。以40个以上细胞组成的细胞团为1个集落。1.5 主要观察指标 小鼠外周血和骨髓造血干细胞表型CD34+细胞含量；外周血中白细胞含量；外周血和骨髓造血干细胞集落形成单位。1.6 统计学分析 实验数据均以s表示，使用GraphPad Prism 5软件进行处理。组间差异使用t 检验或单因素方差分析，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 参加实验60只小鼠，均进入结果分析，中途没有脱落。5357ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH表1 不同处理组外周血造血干细胞表型CD34+细胞含量 (s，n=3，%)Table 1 Concentration of CD34+ cells in the peripheral blood after different treatments表2 不同处理组骨髓造血干细胞表型CD34+细胞含量 (s，n=3，%)Table 2 Concentration of CD34+ cells in the bone marrow hematopoietic stem cells after different treatments时间(h)对照组AMD3100组地塞米松组AMD3100+地塞米松组05.140.075.200.095.110.065.160.0540.07a7.760.05b7.980.0845.190.098.450.06b7.230.08a9.130.11d85.310.147.880.16a6.860.13a8.390.13c125.180.087.560.07a6.470.11a7.970.10c表注：与对照组比较，aP 0.05，bP 0.01；与单一药物组比较， cP 0.05，dP 0.01。时间(h)对照组AMD3100组地塞米松组AMD3100+地塞米松组00.340.030.350.040.370.060.400.0620.410.050.960.07a1.570.11b1.710.1340.440.021.870.10b1.410.09b2.240.15d80.330.041.330.11b1.110.12a1.880.11c120.470.061.050.07a1.010.08a1.650.10c表注：与对照组比较，aP 0.05，bP 0.01；与单一药物组比较， cP 0.05，dP 0.01。表3 不同处理组小鼠外周血白细胞含量(s，n=3，1109 L-1)Table 3 Concentration of leukocytes in the peripheral blood after different treatments表4 不同处理组外周血造血干细胞CFU-Mix集落形成单位(s，n=3，个/106)Table 4 Yields of CFU-Mix in peripheral blood-derived hematopoietic stem cells after different treatments时间(h)对照组AMD3100组地塞米松组AMD3100+地塞米松组05.250.670.945.880.6425.650.4514.361.13a6.281.3718.871.4645.140.6923.130.97b5.211.0425.631.14c85.431.1220.441.34b5.540.6522.410.82c125.860.7416.250.43b5.330.4219.110.65c表注：与对照组比较，aP 0.05，bP 0.01；与单一药物组比较， cP 0.05。时间(h)对照组AMD3100组地塞米松组AMD3100+地塞米松组014.311.3515.641.1316.651.3314.471.33216.120.5719.321.36a22.560.65b24.650.94c417.891.6925.650.78b19.951.46a28.131.87d815.351.9623.460.89b18.641.13a25.351.56c1216.780.8621.971.12a17.860.84a24.100.74c表注：与对照组比较，aP 0.05，bP 0.01；与单一药物组比较， cP 0.05，dP 0.01。时间(h)对照组AMD3100组地塞米松组AMD3100+地塞米松组066.675.5667.835.3563.258.9466.349.67268.767.8388.469.42a65.477.74107.7812.54464.316.31118.4211.73b66.399.46141.2314.62c873.358.8297.866.14b64.016.63115.6811.26c1267.2210.3382.418.36a68.568.6994.378.14表注：与对照组比较，aP 0.05，bP 0.01；与单一药物组比较， cP 0.05。表5 不同处理组骨髓造血干细胞CFU-Mix集落形成单位(s，n=3，个/106)Table 5 Yields of CFU-Mix in bone marrow-derived hematopoietic stem cells after different treatments2.2 小鼠外周血和骨髓造血干细胞表型CD34+细胞含量 向小鼠体内注射AMD3100或地塞米松后，采集外周血和骨髓造血干细胞，使用流式细胞仪检测CD34+细胞含量，结果见表1和表2。AMD3100和地塞米松均可刺激使外周血CD34+细胞含量上升，分别在4 h和2 h时达到高峰，随后CD34+细胞数量逐渐下降。在骨髓中CD34+细胞含量逐渐上升，与外周血中CD34+细胞含量变化基本一致。当联合使用AMD3100和地塞米松时，外周血和骨髓中CD34+细胞含量上升幅度最大，表明联合使用AMD3100和地塞米松可以促进造血干细胞的动员。2.3 小鼠外周血中白细胞含量 向小鼠体内注射AMD3100或地塞米松后，小鼠外周血中白细胞含量在 2 h已经开始上升，小鼠注射AMD3100后4 h外周血白细胞含量达到高峰，注射地塞米松2 h后外周血白细胞含量达到高峰，AMD3100和地塞米松联合用药的小鼠外周血白细胞含量在4 h时达到高峰，随后白细胞含量逐渐下降，但依然显著高于对照组，见表3。AMD3100和地塞米松联合用药组外周血白细胞含量高于其他组，表明两者具有协同作用。2.4 小鼠外周血和骨髓造血干细胞集落形成单位 注射AMD3100的小鼠，外周血和骨髓造血干细胞CFU-Mix集落形成均高于对照组，并且在2 h时集落形成最多，见表4和表5。注射地塞米松的小鼠集落形成数量与对照组无明显差异，联合注射AMD3100和地塞米松形成的集落数高于对照组和单独注射AMD3100的小鼠，表明地塞米松可以加强AMD3100对造血干细胞CFU-Mix集落形成的作用。3 讨论 DiscussionSDF-1/CXCR4在调节细胞的迁移、趋化、黏附、血管生成等方面发挥重要的作用28。SDF-1或CXCR4基因敲除的小鼠会出现骨髓内造血细胞生成减少、血管发育异常以及脑神经异常等现象29。AMD3100和SDF-1竞争绑定到CXCR4受体30，加强SDF-1从骨髓基质细胞释放到外周血中31，从而阻断SDF-1/ CXCR4相互作用，诱导造血干/祖细胞从骨髓释放到外周血循环中32。CD34选择性的表达于早期造血干/祖细胞表面，是造血干细胞分离纯化的主要标记33。因此，临床上常用CD34+细胞含量来表征造血干细胞的含量。Lataillade等34研究表明SDF-1可诱导CD34+造血干/祖细胞的增殖。AMD3100可使释放到外周血的CD34+细胞增多，简化干细胞采集的过程，提高造血干细胞移植的成功 率35。与单用粒细胞集落刺激因子比起来，AMD3100和粒细胞集落刺激因子联合应用可以显著增加非霍奇金氏淋巴瘤患者循环外周血中CD34+细胞含量，提高患者造血干细胞的动员能力36。实验采用流式细胞仪检测发现，AMD3100或地塞米松动员后小鼠骨髓和外周血CD34+细胞明显高于对照组，表明AMD3100和地塞米松都对小鼠造血干细胞有动员作用。外周血中的白细胞数量可间接反映造血干细胞数量，如果外周血中造血干细胞数量增加，白细胞数量也会增加。因此，外周血白细胞数量可以作为反映外周血造血干细胞含量的一个指标。实验发现注射AMD3100或地塞米松均可显著增加外周血中白细胞含量，联合用药具有协同作用。地塞米松能够刺激骨髓的造血功能，使骨髓中中性粒细胞释放到外周血中，增加血液中白细胞含量，可用于治疗白细胞减少症37。注射AMD3100后的小鼠外周血白细胞含量迅速升高4，这与此实验研究结果一致。CFU-Mix集落形成的数量可直接或间接反映细胞悬液中早期造血干/祖细胞的数量及活性38。实验检测了骨髓和外周血CFU-Mix集落形成能力，结果表明使用AMD3100进行动员后CFU-Mix集落形成数量显著高于对照组，AMD3100和地塞米松联合动员的CFU-Mix集落形成数高于单用AMD3100或地塞米松动员组，进一步证明了AMD3100和地塞米松联合作用可以加强小鼠造血干细胞的动员效果。实验中注射地塞米松的小鼠造血干细胞集落形成数量和对照无明显差异。Papoff等39利用体外实验证实，将地塞米松加入早产胎儿的造血祖细胞中，会抑制粒-巨噬细胞克隆形成。在小鼠的粒-单核细胞集落培养体系中加入地塞米松后，粒-单核细胞集落形成受到抑制40。Winkler等41的研究表明单用AMD3100集落形成数量提高了16倍，这与此实验的结果一致。Caulfield等42证明地塞米松以剂量依赖的方式上调外周血单核细胞CXCR4的表达。在人静止T细胞中，地塞米松通过诱导酪氨酸激酶的磷酸化激活下游信号，加强SDF-1/CXCR4介导的信号通路，从而导致微丝聚合和Rac的激活43。AMD3100的药物靶点也是SDF-1/CXCR4信号通路，因此作者推测AMD3100和地塞米松联用，可能通过调控SDF-1/CXCR4介导的信号通路起作用。实验结果表明，AMD3100或地塞米松能够动员造血干细胞从骨髓向外周血迁移，并且AMD3100和地塞米松联合应用，对小鼠造血干细胞动员效果优于单一药物。两者联合的作用机制以及动员的干细胞移植后能否成功重建造血和免疫功能还需要进一步研究。作者贡献：实验设计为燕备战，实验实施为燕备战、马会敏和孔存权，实验评估为梁玉和朱伟彦，资料收集为燕备战、马会敏和蒋舒婷。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009 年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 王东红. 造血干细胞及其潜能J. 卫生职业教育, 2004, 22(6): 121-123.2 Passweg JR, Halter J, Bucher C, et al. 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