伞状植物叶片中蛋白质的分离纯化及分子质量的检测.doc

伞状植物叶片中蛋白质的分离纯化及分子质量的测定 学生：杨双昱 指导老师：张芬琴（河西学院 生命科学与工程系 工程092班 甘肃张掖 73400）摘要：使用凝胶过滤层析法和考马斯亮蓝法及SDS-PAGE电泳技术对伞状植物叶片中可溶性蛋白质的含量及相对分子质量进行测定，凝胶过滤表明：随吸光值的不同，蛋白质的含量也不同。 SDS - PAGE电泳表明：伞状植物叶片中存在大量相对分子质量为20-110KD的蛋白质。关键词：伞状植物叶片；蛋白质；分离纯化；分子量；凝胶过滤；吸光值；SDS-PAGE电泳。引言：伞形科植物(Apiaceae，Umbelliferae)一年生至多年生草本，茎中空或有髓。叶互生，叶片分裂或多裂，一回掌状分裂或一回至四回羽状分裂或一回至二回三出式羽状分裂的复叶；叶柄基部膨大，或呈鞘状。花序常为复伞形花序，有时为单伞形花序；花常两性，整齐；花萼和子房结合，裂齿5 或不明显；花瓣5；雄蕊和花瓣同数，互生；子房下位，2室，每室有1胚珠；花柱2，基部往往膨大成花柱基(stylopodium)，即上位花盘。果实由 2个有棱或有翅的心皮构成，双悬果，每个分果有5条主棱(2条侧棱，2条中棱，1条背棱)，分果背腹压扁或两侧压扁；种子胚乳丰富；胚小。染色体：X4 -12。本科约800属，3000种，分布于北温带、亚热带或热带的高山上，其中有些种类供药用、食用和观赏用。我国约有90属，500多种，全国均有分布。凝胶过滤(gel filtration)是分离纯化蛋白质的有效方法之一，有称凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)，分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等，凝胶过滤层析适用于球状蛋白的分离，在过滤时大分子蛋白不能进入凝胶颗粒的内部而随凝胶颗粒的空隙先流出，而小分子可进入凝胶颗粒内部的多空网状结构，流速缓慢，以致最后流出，从而使样品中分子大小不同的蛋白按顺序分开。SDS-PAGE电泳法（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法）是测定蛋白质分子量的方法。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。1材料与方法1.1样品采集及处理 实验材料采于流泉一社 北面污水池（时间：9/11/2010）。材料采回后洗净，用滤纸吸干水分保存备用。1.2试验方法1.2.1 蛋白质的提取 称取各2g的样品加丙酮石英砂在冰袋上快速充分研磨，将其中一份超声（超4s停8s），另一份冷藏（- 20 ）。然后一起在转速为1000的冷冻离心机中离心10min，取上清液加预冷丙酮放置20的环境中0.5h，再以同样的转速离心10min，保存一份，在取沉淀加4ml的缓冲液溶解，在5000r/min的离心机中离心10min，取上清液保存备用。1. 2. 2蛋白质的分离纯化 用凝胶过滤层析法 1分离纯化蛋白质。使用Sephdex G-75(分级分离的分子量范围3 00080 000)的凝胶装柱（层析柱2530cm），使胶面平正，用洗脱液平衡，测得流速为2min/管，上样，加超声后的蛋白提取液2mm（柱床体积的1-5%），洗脱流速为4min/ 管，每1.5ml为一管收集分离纯化液共22管。然后用考马斯亮蓝染色法2 测蛋白质的吸光值如图1。1.2.3 蛋白质相对分子量的测定采用SDS - PAGE电泳 2 进行蛋白质组分分析，分离胶与浓缩胶的配置如表1。 取原液和沉淀溶解液及部分分离纯化后的蛋白样液共7组各取50l分别加50l还原缓冲液，混合后沸水浴加热3-5min待用。上样量为30l，电泳是所加Marker为10l。 电泳结束后加入染色液染色24 h,之后脱色至蛋白色带清晰为止. 最后在凝胶成像仪中拍照,利用蛋白质单向电泳软件进行相对分子量统计分析.2 结果与分析2.1 蛋白质分离纯化的结果 由蛋白质的吸光值的曲线可知,蛋白质在280nm下，有大量的吸收，图1中有三个峰值，最大吸光度的峰值为0.526，凝胶过滤时大分子量的蛋白质不能进如凝胶内部，而随洗脱液一起先流出，小分子蛋白进入凝胶内部的多空网状结构而后流出。2.2 蛋白质组分分析 根据SDS-PAGE电泳图谱中蛋白质条带可辨颜色的深浅不同（图2）,分离纯化后的杂蛋白减少。不同样液中蛋白质的分子量不同（图3），在原液未超声中包括的蛋白质：94.17 54.46 40.33 15.54KD蛋白，原样超声中包括的蛋白：89.31 51.65 38.25 21.74 15.00 KD蛋白，未超声的沉淀溶解液中包括的蛋白质：90.90 49.86 36.93 21.74 14.23 12.13KD蛋白，超声的沉淀溶解液中包括的蛋白质：90.90 49.86 36.93 23.74 14.48KD蛋白。凝胶过滤中吸光值最大的中包括的蛋白质：114.36 87.74 72.25 62.73 51.65 42.53 15.54KD蛋白。由表2可看出，蛋白质分子量依次减小，相应的迁移率依次增大，即迁移率与分子量成反比。结合图2与表1在280nm下，分子量大的蛋白含量较多。3 讨论凝胶过滤层析可以分离纯化蛋白质，使分子量不同的蛋白分开，分子的先流出，小的后流出，凝胶过滤层析是生物化学中一种常用的分离手段，它设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性，广泛用于蛋白质、核酸、多糖等生物分子的分离纯化。SDS-PAGE电泳可以测蛋白质的分子量，使其依次分开，而根据分子量的大小可以确定蛋白质。经分离纯化后的蛋白质在SDS-PAGE电泳上应只有一条，而试验中的有许多条带，说明分离纯化不完全，一条带中有多种蛋白。电泳图谱中的条带较粗，是应为对样品没有浓缩完全。本实验中的伞状植物来源于污水池旁边，拿它可以与标准的对比，比较蛋白质含量的变化，知道污水对伞形科植物中含蛋白质量的影响。 图1 蛋白质的单项电泳 表1 分离胶与浓缩胶的配置试剂名称分离胶浓缩胶蒸馏水3.35ml6.24ml凝胶贮液4.0ml1.0ml分离胶缓冲液(Ph=8.9 Tris Hcl)2.5ml-浓缩胶缓冲液(Ph=6.7 Tris Hcl)-2.5ml10%SDS0.1ml 0.1ml10%TEMED5l10l10%AP50l50l 图2 蛋白质的洗脱曲线表2（1） SDS-PAGE电泳法测的蛋白质的分子量泳道1(标准)泳道2泳道3泳道4条带1迁移率分子量迁移率分子量迁移率分子量迁移率分子量条带23220.0034118.4836114.365089.31条带342105.004990.905187.746074.85条带45371.006370.986272.258349.86条带58150.007161.637062.731828.68条带611535.0014915.548151.65条带714216.001789.319242.53条带814915.54表2（2）SDS-PAGE电泳法测的蛋白质的分子量泳道5泳道6泳道7泳道8条带1迁移率分子量迁移率分子量迁移率分子量迁移率分子量条带24990.904990.905089.314794.17条带38448.998349.868151.657854.46条带410036.9310036.939838.259540.33条带512523.7413021.7413021.7414915.54条带615314.4815414.2315115.00条带71