RNAi用于基因功能的鉴定和确证

,RNAi(shRNA/miRNA)用于基因功能的鉴定和确证,广州复能基因有限公司李华平博士 研发部主任,FulenGen,FulenGen,Gene Function Screening,Mechanism of RNAi (shRNA/miRNA),Comparison of shRNA and miRNA properties,Architecture short hairpin Single-strandOriginal Exogenous EndogenousNo. of intended target 1 ManyDegree of gene silence High LowComplementary to mRNA target Perfect ImperfectEffect on mRNA Endonucleolytic cleavage Repressed translation,shRNA miRNA,FulenGen,FulenGen,shRNA的设计与构建 shRNA的验证 miRNA的克隆与检测 miRNA靶标的确证 基因沉默后的功能拯救,FulenGen,FulenGen,shRNA 表达克隆的构建,载体选择 筛选标记和报告基因 目的细胞,shRNA序列设计 高准确性的预测方法 茎和环序列,有效性检测 3-5个shRNA /基因 目的基因是否表达,克隆和测序 合成引物的长度 茎环结构难以有效测序,保证高表达抑制效率和最低的脱靶效应； 慢病毒载体和以哺乳动物细胞表达载体；序列已经过测序；每个基因提供4个克隆，至少有1抑制水平达到70%以上提供包含不规则序列的阴性对照克隆来比较研究。,OmicsLink shRNA表达克隆,FulenGen,经过验证的人类激酶组shRNA表达克隆 350个人类激酶基因的确证shRNA表达克隆 表达抑制效应都经过验证，达70以上 低的脱靶效应。,FulenGen,shRNA克隆用于信号通路研究,qPCR Primer array 即将上市,采用先进的算法，精心设计的qPCR引物 扩展长度100250bp； PCR扩展效率90%； 每对引物的都经过扩展曲线、溶解曲线和电泳检测，包括扩展的特异性,ExonicNon-coding,MicroRNAs 由RNA Polymerase II转录,IntronicNon-codingand coding,Lee, et al., EMBO J. 23:4051-60 2004,/-OH,mature and primary microRNA 的结构,Pri-miRNA,Drosha Cleavage site,Mature,Vector-Based microRNA Expression Clones,FulenGen,III 型启动子,II 型启动子,Vector-Based microRNA Expression Clones,FulenGen,OmicsLink Human Precursor miRNA Expression Clones,pEZ-MR02,650种前体miRNA表达克隆涵盖了miRBase（11.0版本）中已知的678种miRNA的95% miRNA表达框已完全测序确证 基于慢病毒载体系统的表达克隆可转染未分化细胞和难转化的细胞，获得与普通分化细胞类似的转染效率 提供被转染细胞的存活性的筛选基因，可用于稳定或瞬时表达调控 通过应用eGFP可以监测病毒和质粒载体的转染效率,FulenGen,miRNA与肿瘤,miRNA的检测和定量,检测方法 Nothernblot Microarray Quantitative Real-time PCR,检测对象 Primary-miRNA Pre-miRNA Mature miRNA,FulenGen,Quantitative Real-time PCR detect miRNA,polyA加尾法,Loop反转录法,通用性高；适用于同一样本检测多种miRNA经济、方便,特异性高；适用于多个样本中检测同一miRNA价格较高,FulenGen,qPCR 检测miRNA的特异性,qPCR检测miRNA的特异性,qPCR 检测miRNA困难,采用LNA探针,miRNA Target的分析,研究发现，在哺乳动物中，miRNAs的基因抑制作用是通过其5一段长为68nt的核苷酸与mRNAs3端非翻译区域相结合实现的。一般这段核苷酸位于 miRNA序列5的28个nt，被称为seed区。2007年，美国约翰霍普金斯大学发现miR-29b 5的6个核苷酸与该miRNA的细胞定位有关。,FulenGen,miRNA 5的seed区域在miRNA家族中具有很高的保守性，对脊椎动物的miRNA target的识别具有重要的作用，尤其是第2-8个碱基。,FulenGen,针对HDAC5的三个不同版本的算法的microRNA的预测结果,红色表示第三和第四版重叠的microRNA，黄色表示第四和第五版重叠的microRNA,microRNA,Translation,DegradeationOr Translation inhibition,Light,No Light,Renilla Luciferase data,Firefly Luciferase data,miRNA的编辑及其靶标的变化,miR376a-5p 经过编辑后，其靶标的变化,FulenGen,OmicsLink Human miRNA Target Sequence (3 UTR) Expression Clones,pEZX-MT01,pEZX-MT02,FulenGen,Gaussia luciferase expression in CHO cells,FulenGe