邓旭明郑州20170827中药成分抗耐药酶的基础和应用研究

,Copyright 2009 by Xuming Deng All rights reserved.,中药成分抗耐药酶的基础和应用研究,邓旭明,吉林大学动物医学学院,2017.08.27 郑州,背景介绍,病原微生物,固有耐药性2. 突变耐药性（诱导突变、自发突变）3. 获得耐药性（转化、转导、接合、转座）,遗传变异,细菌耐药性是微生物的一种天然抗生现象,1. 细菌耐药性的产生,1. 细菌耐药性的产生,绝大多数抗生素进入临床后期都会产生相应的耐药菌,被杀死的病原菌,存活的病原菌,抗生素,耐药菌,1. 细菌耐药性的产生,抗生素的不合理使用促进了耐药性的产生,新药研发的速度赶不上耐药性发生和发展的速度,耐药性的发展终将导致人类无药可用,超级耐药菌,1. 细菌耐药性的产生,仅通过研发新的抗生素难以应对愈演愈烈的耐药性,1. 细菌耐药性的产生,合理使用抗生素控制耐药性的发展降低耐药菌的毒力是控制耐药菌的另一策略针对耐药机制进行抑制剂研发,2. 细菌耐药性的机制,表型改变,产生耐药酶类,改变靶位结构,改变膜通透性,改变代谢途径,靶位修饰后与抗菌药亲和力降低，如林可胺类合成替代靶蛋白，如耐甲氧西林金葡菌（MRSA）,2. 细菌耐药性的机制 改变靶位结构：,降低细胞壁的渗透性和细胞膜的通透性（水通道蛋白缺乏）、转运系统减少、主动外排系统增加见于喹诺酮类、大环内酯类等,2. 细菌耐药性的机制 改变膜通透性：,二氢蝶酸合成酶生成增多、直接利用外源性叶酸见于磺胺类耐药,2. 细菌耐药性的机制 改变代谢途径：,耐药酶是细菌产生耐药性最主要的方式常见的耐药酶包括：-内酰胺酶(BLA)、氯霉素乙酰转移酶、氨基糖苷类钝化酶及修饰酶等,2. 细菌耐药性的机制 产生耐药酶：,3.重要耐药酶,以毒力因子为靶标的药物研发受到关注,祖国医学认为， 任何疾病的产生都离不开内因和外因。灵素节注类编曰：“方脉所主，病证多端，总其纲要，不出外感、内伤两门。”内因主要是指人体正气虚衰，脏腑失调，气血失和以及七情内伤；外因指六淫之邪和疫戾之气，当人体正气虚衰，邪气乘虚而入会导致疾病的发生。所谓“邪之所凑，其气必虚”。 传统中医药学虽无感染和抗感染一类现代医药学的文字记载,但有关卫外机能不固，六淫、疫疠之气等外邪引起的伤寒、时病和散寒、清热、解毒等治法实已包含有现代医药学感染和抗感染的内容。,2010年中国兽药典共收录成方制剂191个，其中103个具有不同程度抗感染的作用，占总数的53.9%。目前临床常见的疾病以呼吸系统疾病和消化泌尿系统疾病为主，2010药典收录的成方中，总计73种成方针对这3类疾病，占抗感染方剂的70.9%,抗感染成方制剂,非抗感染成方制剂,一、背景,抗感染方剂用药212味,共有13类药,药物出现总频次为756次。解表药、清热药、祛湿药、化痰止咳平喘药、补虚药是构成治疗感染性疾病的主要药物,出现频率明显高于其它种类的药物。其中,仅在成方功能中提到清热的就有54个方剂，占药典方剂总数的28.3%，占抗感染方剂的52.4%。清热药又以清热解毒、清热燥湿、清热泻火、清热凉血药为主;祛湿药以利湿药为主;补虚药以补气药为主。由药物反推病证,可见目前对于感染性疾病的防治主要是从祛除表邪、热邪、湿邪、化痰止咳平喘和改善机体状态几方面入手的，即在抵御外感的同时，调节内因，提高机体正气，达到治疗疾病的效果。因此中医用药主要包括调节机体主动抗感染和药物抗感染作用,着重体现中医整体观念和辨证施治的特征。,一、背景,作用机制尚不明确,药理效果明确,目前，中药对病原微生物，尤其是细菌，的药效学得到广泛的研究，其主要研究热点为抑制或杀灭病原微生物的活性，但是其作用机制尚不明确。,中药抗细菌性感染的机制尚不明确,一、背景,中药抗感染机制可能不是依赖于其抑菌或杀菌途径,抗感染,抑菌或杀菌活性？,中药单体的血浆浓度,中药单体对病原菌的最小抑菌浓度,vs,中药及其化学成分抗感染潜在策略：抗毒力,宿主,病原菌,中药,Koster et al. (2014),耐药酶,抑菌,杀菌,抗毒力,机体作用,1、揭示了中药耐药性低的机制,传统抗生素,有效，但选择压力大,表面蛋白,外毒素,耐药基因,毒力因子非生命所必须成分，故选择压力小,Cegelski et al. (2008),Walsh et al. (2003),中药,一、背景-中药抗病原菌感染的总结,中药与免疫系统的双重作用下更有效的清除病原菌,传统抗生素,作用效果差,中药,中药,解除细菌耐药性,抗毒力,免疫系统,双重作用,有效清除,2、抗毒力中药可协同机体免疫系统防治耐药菌感染,一、背景-中药抗病原菌感染的总结,传统抗生素,中药（抗毒力）,直接以病原菌为靶标，抑制或者杀灭病原菌为目的，效果更快，但更容易导致耐药性的发生和发展,以病原菌的毒力因子为靶标，降低细菌的耐药性及致病力，使得宿主的免疫系统更有效和更快的清除病原菌而发挥其干预感染过程的作用效果。,清除,3、揭示了中药药效比传统抗生素慢的机制,病原菌,免疫系统,一、背景-中药抗病原菌感染的总结,4、天然化合物作用效果具有特异性,针对不同耐药酶，中药复方或许需要作出相应的改变,厚朴酚,抑制生物学活性,无任何干预作用,NDM-1,TEM-1,一、背景-中药抗病原菌感染的总结,5、天然化合物作用靶标具有多样性,某些天然化合物可能具有抗不同耐药酶的作用,化合物B,抑制活性,NDM-1,MCR-1,抑制活性,小分子与耐药酶结合：非化学键，结合力低，与空间结构相关,一、背景-中药抗病原菌感染的总结,中西联合用药,减少用药量,降低耐药性,延长使用寿命,In addition, these anti-virulence drugs could potentially be used in combination with established or novel antimicrobials in a synergistic manner to extend the lifespan of these drugs.,Rasko DA, Sperandio V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nat Rev Drug Discov. 2010 Feb;9(2):117-28.,6、为中西联合用药提供理论基础,一、背景-中药抗病原菌感染的总结,现代医学的发展为针对特定病原菌的特定毒力因子设计抗毒力中药提供可能,传统中医,何种致病菌？何种毒力因子？,中药方剂,现代医学,致病菌耐药机制和致病机制的透彻研究,抗毒力中药,7、现代医学发展为抗毒力中药临床应用提供可能性,一、背景-中药抗病原菌感染的总结,8、为中药新药研发奠定了基础,药效,作用机制,药动,中药单体血浆浓度,中药单体对病原菌的MIC值,一、背景-中药抗病原菌感染的总结,9、中药抗毒力药物未来应用前景,可行：1）沙门氏菌感染（鸡白痢）2）产气荚膜梭菌感染（鸡坏死性肠炎）3）肺炎（金葡菌或肺炎链球菌）部分可行4）NDM-1阳性菌感染5）金葡菌或链球菌等革兰氏阳性菌感染6）奶牛乳房炎,一、背景-中药抗病原菌感染的总结,10、客观看待中药抗细菌性感染的应用,尚无证据表明中药天然化合物对菌血症或败血症有效,临床应用限制：黄酮类化合物水溶性差，口服生物利用度低,一、背景-中药抗病原菌感染的总结,二、中药对耐药酶作用的研究,中药对耐药酶作用的研究,二、中药对耐药酶作用的研究,1. 天然化合物对部分BLA抑制活性的研究,-内酰胺酶(BLA)是最重要的一类耐药酶，也是最早最经典的耐药形式，主要见于肠杆菌科细菌BLA首次发现于青霉素临床应用之前BLA能够与-内酰胺环上的羰基共价结合，水解酰胺键，使-内酰胺类抗生素开环失活。,二、中药对耐药酶作用的研究,1. 天然化合物对部分BLA抑制活性的研究,-内酰胺酶的分类：Ambler法：根据氨基酸序列的同源性分为A-D的四类Bush-Jacoby-Medeiros法：根据底物和抑制剂的构型分成1-4的四组,二、中药对耐药酶作用的研究,成功建立BLA抑制剂筛选平台,1. 天然化合物对部分BLA抑制活性的研究,已成功筛选到部分抑制剂，可显著抑制-内酰胺酶的生物学活性,除NDM-1外，本课题组还进行了其他BLA抑制剂的筛选工作,二、中药对耐药酶作用的研究,成功建立BLA抑制剂筛选平台,所得抑制剂与青霉素联用可产生显著的协同效果,（FICI1/2时为协同效果）,1. 天然化合物对部分BLA抑制活性的研究,二、中药对耐药酶作用的研究,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,Monolekha,2013,Michael P. S. Booth，2015,Alain,2016,David A, 2013,Class A,Class B,Class C,Class D,NDM-1,二、中药对耐药酶作用的研究,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,新德里-内酰胺酶-1（NDM-1）是2008年在印度新德里首次报道发现的一种金属-内酰胺酶（MBLs），由位于质粒的 blaNDM-1基因编码。NDM-1活性中心含有一或两个Zn2+，能水解除单环类（氨曲南）以外的全部-内酰胺类抗生素。,二、中药对耐药酶作用的研究,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,NDM-1基因可通过质粒在不同菌株之间传播，使得大量原本对常规抗生素敏感的细菌也迅速获得强大的耐药性。且NDM-1通过突变可不断产生新的MBLs，加剧了细菌耐药性的产生。,耐药基因在不同菌株间迅速传播,二、中药对耐药酶作用的研究,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,目前，携带NDM-1基因的耐药菌对除替加环素、多粘菌素外的所有抗生素均具不同程度耐药性,对绝大多数抗生素均不敏感的超级细菌,二、中药对耐药酶作用的研究,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,-内酰胺类抗生素是临床中最为常用的抗生素,-内酰胺酶,耐药菌株,分泌,治疗失效,-内酰胺药物,NDM-1的出现严重影响了-内酰胺类抗生素的应用,二、中药对耐药酶作用的研究,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广、抗菌活性最强的非典型-内酰胺类抗生素，对绝大多数BLA稳定，是治疗肠肝菌科严重感染的“最后防线”。NDM-1的出现同样威胁到碳青霉烯类抗生素的使用。,抗生素在与细菌耐药性的博弈中已处于下风,二、中药对耐药酶作用的研究,成功建立NDM-1抑制剂筛选平台,筛选-内酰胺酶抑制剂,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,天然化合物,评价协同抑菌效果,与抗生素联用,体外酶抑制试验,二、中药对耐药酶作用的研究,筛选得到厚朴酚作为NDM-1抑制剂,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,二、中药对耐药酶作用的研究,厚朴酚对NDM-1阳性大肠杆菌生长无显著影响,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,二、中药对耐药酶作用的研究,厚朴酚与美罗培南联用能够恢复抗生素的抗菌活性,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,受试化合物对NDM-1阳性大肠杆菌MIC值（g/mL）,美罗培南与厚朴酚联用，其MIC值降低了四倍FICI指数=0.281，提示二者具有协同作用,二、中药对耐药酶作用的研究,厚朴酚联用美罗培南可完全杀灭NDM-1阳性菌,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,二、中药对耐药酶作用的研究,联合用药能够显著提高感染NDM-1阳性大肠杆菌感染小鼠的存活率,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,二、中药对耐药酶作用的研究,降低感染小鼠肝脏（左）及脾脏（右）中的菌落定植数,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,二、中药对耐药酶作用的研究,联合用药能够显著缓解肝脏脾脏的病理损伤,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,二、中药对耐药酶作用的研究,分子动力学模拟表明厚朴酚能够直接结合至NDM-1活性中心，影响NDM-1与底物的结合而降低其活性,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,二、中药对耐药酶作用的研究,突变子与厚朴酚结合力显著下降，说明上述氨基酸残基为厚朴酚与NDM-1结合位点,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,根据分子动力学模拟结果，选择厚朴酚与NDM-1主要结合位点(K221、G219及H250)进行定点残基突变，测定突变子与厚朴酚的结合自由能及结合常数（KA）,二、中药对耐药酶作用的研究,厚朴酚对NDM-1突变子抑制活性显著降低,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,二、中药对耐药酶作用的研究,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,厚朴酚对NDM-1的表达及稳定性无显著影响,二、中药对耐药酶作用的研究,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,小结：1.通过硝噻吩水解试验，筛选得到厚朴酚这一NDM-1酶抑制剂；2.体外实验证明厚朴酚通过对NDM-1的抑制作用能够恢复美罗培南的抑菌活性；3.体内实验证明二者联用可显著提高感染小鼠的存活率、降低肝脾菌落定植数，缓解病理损伤；4.分子动力学模拟表明，厚朴酚能够结合到NDM-1的活性中心，进而抑制其生物学活性。,二、中药对耐药酶作用的研究,2. 天然化合物对NDM-1抑制活性的研究,以上结果表明厚朴酚可能是一种潜在的NDM-1酶抑制剂，通过其与-内酰胺类抗菌药物的联合应用，能够恢复抗生素的抗菌活性。,二、中药对耐药酶作用的研究,3. MCR-1抑制剂作用的研究,我国多地采集的不同样本中均检测到质粒携带的MCR-1基因,Lancet Infect Dis 2016;16: 16168,SHP45,Mobile Colistin Resistance gene (MCR-1),二、中药对耐药酶作用的研究,3. MCR-1抑制剂作用的研究,随后，在全球范围内多个国家均检测到MCR-1基因,Lancet Infect Dis 2017; 17: 40010,二、中药对耐药酶作用的研究,3. MCR-1抑制剂作用的研究,MCR-1基因陆续被发现存在于多种不同型的质粒上,二、中药对耐药酶作用的研究,3. MCR-1抑制剂作用的研究,Lancet Infect Dis 2017; 17: 40010,MCR-1的发现导致多粘菌素耐药性的产生,二、中药对耐药酶作用的研究,3. MCR-1抑制剂作用的研究,我国和欧洲已经针对多粘菌素的使用采取措施,二、中药对耐药酶作用的研究,3. MCR-1抑制剂作用的研究,多粘菌素主要耐药机制,二、中药对耐药酶作用的研究,3. MCR-1抑制剂作用的研究,MCR-1在功能上与磷酸乙醇胺转移酶相同,LptA,MCR-1,二、中药对耐药酶作用的研究,3. MCR-1抑制剂作用的研究,细菌耐多粘菌素的机制尚不完全清楚,？,？,二、中药对耐药酶作用的研究,3. MCR-1抑制剂作用的研究,MCR-1与产多粘菌素类芽孢杆菌磷酸乙醇胺转移酶EptA同源性很高,Lancet Infect Dis 2016;16: 16168,二、中药对耐药酶作用的研究,3. MCR-1抑制剂作用的研究,含有MCR-1质粒的W3110大肠杆菌脂质体A的组成发生明显改变,二、中药对耐药酶作用的研究,成功建立BLA抑制剂筛选平台,3. MCR-1抑制剂作用的研究,多粘菌素,化合物,MCR-1产生“耐药”,完全杀菌,对细菌生长无影响,化合物针对特定靶点，结合抗生素杀灭耐药菌,二、中药对耐药酶作用的研究,成功建立BLA抑制剂筛选平台,3. MCR-1抑制剂作用的研究,发现MCR-1抑制剂，可显著提高携带MCR-1质粒细菌的敏感性,抑制剂,二、中药对耐药酶作用的研究,成功建立BLA抑制剂筛选平台,3. MCR-1抑制剂作用的研究,化合物z对细菌生长无影响，不会造成耐药性,二、中药对耐药酶作用的研究,成功建立BLA抑制剂筛选平台,3. MCR-1抑制剂作用的研究,初步验证抑制剂联合多粘菌素可杀灭耐药菌,0 8 32 /(g/mL),二、中药对耐药酶作用的研究,成功建立BLA抑制剂筛选平台,3. MCR-1抑制剂作用的研究,成功建立动物模型，化合物Z联合多粘菌素B具有一定的保护效果,二、中药对耐药酶作用的研究,成功建立BLA抑制剂筛选平台,3. MCR-1抑制剂作用的研究,继续开展MCR相关研究,以上研究受到国家自然科学基金重点项目（项目编号：31130053）、国家自然科学基金国际重点合作项目（项目编号： 31620103918 ）、973计划（项目编号：2013CB127200）、863计划（项目编号： 2012AA020303 ）和的资助，在此表示感谢！,汪洋 教授,刘钟杰 教授,合作者：中国农业大学汪洋教授和刘钟杰教授,近年来主要从事：1）抗细菌感染新靶标的发现及先导结构的筛选；2）天然药物及抗菌药物的抗炎作用及其机制和3）细菌细胞及分子感染机制及免疫调控等研究；主持承担国家科技支撑计划项目（项目联合首席科学家）、国家自然科学基金国际重点合作项目、国家自然基金重点项目和973计划课题等10余项；获教育部高等学校自然科学奖二等奖1项，国际/国内授权专利5项；在领域内知名期刊Plos pathogens，Journal of Infectious Diseases，Biochemical pharmacology，Front Cell Infect Mi，The Journal of Biological Chemistry，Antimicrobial Agents and Chemotherapy和Scientific Reports等发表SCI论文130余篇。代表性论文如下：,后记,Xiang H, Feng Y, Wang J, Liu B, Chen Y, Liu L, Deng X, Yang M. Crystal structures reveal the multi-ligand binding mechanism of Staphylococcus aureus ClfB. PLoS pathogens 2012; 8:e1002751.(Impact Factor:7.003 )(通讯作者) Qiu J, Niu X, Dong J, Wang D, Wang J, Li H, Luo M, Li S, Feng H, Deng X. Baicalin protects mice from Staphylococcus aureus pneumonia via inhibition of the cytolytic activity of alpha-hemolysin. The Journal of infectious diseases 2012; 206:292-301. (Impact Factor:6.344 )(通讯作者)Wang JF, Qiu JZ, Tan W, Zhang Y, Wang HS, Zhou X, Liu S, Feng HH, Li WH, Niu XD, Deng XM. Fisetin Inhibits Listeria monocytogenes Virulence by Interfering With the Oligomerization of Listeriolysin O. Journal of Infectious Diseases 2015; 211:1376-87. ( Impact Factor: 6.344) (通讯作者),后记,4. Wang J, Zhou X, Liu S, Li G, Zhang B, Deng X, Niu X. Novel inhibitor discovery and the conformational analysis of inhibitors of listeriolysin O via protein-ligand modeling. Scientific reports 2015; 5:8864. ( Impact Factor: 5.228) (通讯作者) 5. Li H, Zhao X, Wang J, Dong Y, Meng S, Li R, Niu X, Deng X. beta-sitosterol interacts with pneumolysin to prevent Streptococcus pneumoniae infection. Scientific reports 2015; 5:17668. ( Impact Factor: 5.228) (通讯作者) 6. Wang JF, Liu BW, Teng ZH, Zhou X, Wang XY, Zhang B, Lu GJ, Niu XD, Yang YJ, Deng XM. Phloretin Attenuates Listeria monocytogenes Virulence Both In vitro and In vivo by Simultaneously Targeting Listeriolysin O and Sortase A. Front Cell Infect Mi 2017; 7. (Impact Factor: 5.218)(通讯作者),后记,7. Li H, Chen Y, Zhang B, Niu X, Song M, Luo Z, Lu G, Liu B, Zhao X, Wang J, Deng X. Inhibition of sortase A by chalcone prevents Listeria monocytogenes infection. Biochemical pharmacology 2016; 106:19-29. ( Impact Factor: 5.091) (通讯作者)8. Dong J, Qiu J, Zhang Y, Lu C, Dai X, Wang J, Li H, Wang X, Tan W, Luo M, Niu X, Deng X. Oroxylin A inhibits hemolysis via hindering the self-assembly of alpha-hemolysin heptameric transmembrane pore. PLoS computational biology 2013; 9:e1002869.(Impact Factor:4.587 )(通讯作者)9. Dong J, Zhang Y, Chen Y, Niu X, Zhang Y, Li R, Yang C, Wang Q, Li X, Deng X. Baicalin inhibits the lethality of ricin in mice by inducing protein oligomerization. The Journal of biological chemistry 2015; 290:12899-907. ( Impact Factor: 4.258) (通讯作者),后记,10. Dong J, Zhang Y, Chen Y, Niu X, Zhang Y, Yang C, Wang Q, Li X, Deng X. Baicalin inhibits the lethality of Shiga-like toxin 2 in mice. Antimicrobial agents and chemotherapy 2015; 59:7054-60. ( Impact Factor: 4.415) (通讯作者) 11. Xinxin C, Chi C, Xiao C, Xue X, Yongjun Y, Junqing C, Xuming D. Florfenicol inhibits allergic airway inflammation in mice by p38 MAPK-mediated phosphorylation of GATA 3. Clinical immunology 2011; 138:231-8.(Impact Factor:4.034 )(通讯作者)12. Zhao X, Li H, Wang J, Guo Y, Liu B, Deng X, Niu X. Verbascoside Alleviates Pneumococcal Pneumonia by Reducing Pneumolysin Oligomers. Molecular pharmacology 2016; 89:376-87.（Impact Factor：3.931）(通讯作者),后记,13. Niu XD, Qiu JZ, Wang X, Gao XH, Dong J, Wang JF, Li HG, Zhang Y, Dai XH, Lu CJ, Deng XM. Molecular insight into the inhibition mechanism of cyrtominetin to alpha-hemolysin by molecular dynamics simulation. Eur J Med Chem 2013; 62:320-8.(Impact Factor:3.902 )(通讯作者)14. Qiu J, Feng H, Lu J, Xiang H, Wang D, Dong J, Wang J, Wang X, Liu J, Deng X. Eugenol reduces th