酵母RNA的提取及组份鉴定与核酸的定量测定

酵母RNA的提取及组份鉴定与核酸的定量测定,目的要求,（）了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。（）了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。（）学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。,实验原理,由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。,实验原理,核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用 来表示。 为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）（表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。,实验原理,蛋白质也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm出的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nmx吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混在有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法先除去。,试剂和器材,1、0.04M NaOH溶液；2、95%乙醇；1.5M硫酸；3、浓氨水；4、0.1M硝酸银；5、酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl；5、三氯化铁浓盐溶液：将2mL 10三氯化铁（FeCl3 6H2O）溶液加入400mL浓HCl；6、苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液：称取6g苔黑酚溶于95乙醇100mL。7、定磷试剂：（1） 17硫酸：将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中；（2）2.5鉬酸铵：2.5g鉬酸铵溶于100mL水中；（3）10抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL 水，棕色并保存溶液；临用时将三种溶液和水按下列比例混合：17硫酸：2.5鉬酸铵：10抗坏血酸：水1：1：1：2（V/V）。8、钼酸铵过氯酸沉淀剂：取3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵2.5%过氯酸溶液。9、5-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍。,二、材料干酵母粉。三、器材移液管0.2mL（1），0.5mL（2），1mL（4），2mL（4）；滴管；容量瓶50mL（3）；量筒10 mL（1）；离心机；分光光度计；冰浴；水浴锅。,操作方法,一、酵母RNA提取称5g干酵母粉悬浮于30mL 0.04M NaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管。3000转/分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入10mL酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心3min。弃去上清液。用95乙醇洗涤沉淀两次。再用乙醚洗涤沉淀一次后，用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算：,二、RNA组份鉴定,取2g提取的核酸，加入1.5M硫酸10mL, 沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。1嘌呤碱：取水解液1mL 加入过量浓氨水。然后加入1mL 0.1M硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。2核糖：取水解液1mL，三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。3磷酸：取水解液1mL，加定磷试剂1mL。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。,三、紫外吸收法测定核酸的含量,1准确称取待测核酸样品0.5g，加少量0.01mol/L NaOH调成糊状，再加适量水，用5-6%氨水调至pH7.0，定容至50mL。2取两支离心管，甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水，乙管加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在冰浴上放置30min。3在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。,四、计算：,式中， 为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值；L比色杯的厚度，1cm；N为稀释倍数；0.024每