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文档简介

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）原理：蛋白质或多肽与SDS结合，经热变性和二硫键的还原，形成所带负电荷相对一致的非折叠衍生物，其泳动速度主要由分子量决定。,凝胶的制备：凝胶由分离胶和浓缩胶组成：上层为浓缩胶，凝胶孔径较大，没有分子筛效应，其pH为6.8，由于快慢离子所形成的高电压梯度，使得变性蛋白质分子在泳动中被压缩为很薄的一层，大大提高了分辨率。下层为分离胶，凝胶孔径较小，有分子筛效应，pH为8.8，变性蛋白质分子所带负电荷基本一致，泳动速度主要决定于分子量。,制备顺序为先灌制分离胶，然后在分离胶上灌制浓缩胶： （四人一组）1. 在两块玻璃板间夹以垫条，用手夹住玻璃板放入电泳槽主体内，缺口朝外，再插入斜楔板。2. 拿一小烧杯，按下表加入各试剂： （12分离胶）单体溶液                                 4ml分离胶缓冲液（pH8.8）    2.5ml超纯水                                   3.3ml10SDS                               100ul10TEMED                         30ul10%过硫酸铵                        70ul,3. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入两玻璃板间，灌注高度为红色背景下沿线。然后滴上少量水饱和异丁醇，静置约15分钟。4. 待凝胶与异丁醇出现分层时，倒去异丁醇，用洗瓶冲洗凝胶顶部，然后拿一烧杯，按下表加入各试剂： （4浓缩胶）单体溶液                                 0.4ml浓缩胶缓冲液（pH6.8）    0.38ml超纯水                                   2.15ml10SDS                                   30ul10TEMED                            15ul10%过硫酸铵                           30ul,5. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入已制好分离胶的玻璃板间，灌满后，小心插入梳子，静置30分钟。6. 待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。小心取出玻璃板，取掉垫条后，缺口朝内放入电泳槽主体，插入斜楔板。    两组用一个电泳槽主体，两组玻璃板间即为上槽。7. 装好的电泳槽主体放入下槽，往上下槽加入    Tris甘氨酸电极缓冲液。用滴管冲洗凝胶顶部，并赶走底层的气泡。,样品制备：蛋白质样品需变性并结合SDS，形成所带负电荷相对一致的非折叠衍生物。四人一组，取一1.5离心管，加入30ul鼠IgG样品和30ul样品缓冲液，混匀后沸水浴5分钟
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