克霉唑对口腔癌的影响

The In Vitro and In Vivo Antitumor Effects of Clotrimazole on Oral Squamous Cell Carcinoma,汇报人:于金钊2016.8.4,通讯作者：程斌单位：中山大学光华口腔医学院副院长,汇报内容:一、背景二、目的三、方法四、结果五、讨论六、结论,一、实验背景1、克霉唑，咪唑类抗真菌药物。20世纪80年代开始应用于口腔念珠菌病，皮肤感染及免疫力低下病人口咽念珠菌病的预防。2、克霉唑已经发现对多种肿瘤有抗肿瘤的作用，如肺癌，大肠癌，乳腺癌和子宫内膜癌。但大都是腺癌。对鳞癌的研究较少。,3、口腔鳞状细胞癌是最常见的口腔恶性肿瘤，占80%-90%，五年生存率在最近几十年没有显著改善。因此寻找新的有效的抗癌药物是非常必要的。,二、实验目的本实验旨在探究克霉唑对OSCC的影响，以及可能的抗肿瘤机制。,三、实验方法及结果1、体外实验：选取CAL-27、SCC-25、UM1三种OSCC细胞系，用不同浓度的克霉唑溶液处理1)细胞生存能力试验2)细胞集落形成试验3)细胞周期检测4)凋亡分析5)蛋白质印迹：Bax、Bcl-2,2、动物实验：选用CAL-27建立裸鼠皮下移植瘤模型,5*106背部皮下,10天后分成治疗组、对照组,腹腔内注射克霉唑，6次/周，2周,腹腔内注射花生油，6次/周，2周,1）肿瘤体积2）肿瘤重量3）免疫组化：增殖细胞核抗原（PCNA）、cleaved caspase- 34）蛋白质印迹：Bax、Bcl-2,1、细胞生存能力试验（CCK8）不同浓度的克霉唑溶液与细胞共培养后，加入CCK8，检测OD450,结果：克霉唑以剂量依赖型和时间依赖型模式，在全部三种OSSC细胞系中抑制细胞增殖,2、细胞集落形成试验：将OSCC接种到不同浓度的克霉唑的培养基中，培养2周。之后固定、染色，光镜下观察，大于50个细胞的群落参加计数。,克霉唑显著降低了体外群落形成。,3.细胞周期检测：细胞先后进行饥饿处理和不同浓度的克霉唑溶液处理，之后收集固定，并用RNase A 处理，清除RNA,PI染色DNA.周期分布用流式细胞仪测定。,造成了周期停滞在G0/G1，期比例下降,4、凋亡分析：不同浓度克霉唑溶液处理细胞后，用Annexin V-FITC/PI双染染料染色，流式细胞术进行凋亡数据的收集和分析,结果：克霉唑可以诱导细胞凋亡,5、蛋白质印迹分析：对照组（DMSO溶液）和实验组（40uM克霉唑）溶液分别处理细胞12h，24h，48h，将细胞裂解，收集总蛋白，测定蛋白含量，电泳，免疫反应。,显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡细胞Bax的表达。,二、动物实验1、肿瘤体积和瘤重,在CAL-27异位移植瘤模型中，显著抑制了肿瘤生长,2、免疫组化：PCNA、凋亡蛋白 cleaved capase- 3,克霉唑能抑制裸鼠肿瘤中PCNA的表达,克霉唑可以上调凋亡蛋白 cleaved capase- 3的表达,3、蛋白质印迹：,显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡细胞Bax的表达。,实验结果：1、克霉唑以剂量依赖型和时间依赖型模式，在全部三种OSSC细胞系中抑制细胞增殖，同时显著降低了体外群落形成。2、导致周期停滞在G0/G1期3、诱导细胞凋亡，显著抑制抗凋亡蛋白BCL-2的表达，上调促凋亡细胞bax的表达。4、在CAL-27异位移植瘤模型中，显著抑制了肿瘤生长和细胞增殖，显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡细胞Bax的表达。,四、讨论：这篇文献第一次将克霉唑的促凋亡作用与Bcl-2家族联系起来，但具体通路不明确，后续需要继续研