专题2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数

专题2微生物的培养和应用,合肥八中 宋 晖,内容纲要,2.1 微生物的实验室培养2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数2.3 分解纤维素的微生物的分离,课题背景,尿素CO(NH2)2重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用 CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3,课题目的：分离产生脲酶的细菌,（1）自然界中目的菌株筛选的依据是根据它对 的要求，到相应的环境中去寻找。（2）实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时 或 其他微生物生长。,生存环境,目的菌株,抑制,阻止,（一）筛选菌株,研究思路,提出的问题 如何寻找耐高温的酶？,选择培养基： 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。菌株： 纯且活状态所保存的菌种 。,研究思路,（一）筛选菌株,研究思路,KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。,该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？ 此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,碳源：葡萄糖、尿素,氮源：尿素,能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。,以尿素唯一氮源,（二）统计菌落数目： 1、活体计数法（稀释涂布平板） （1）操作方法： 稀释涂布平板统计菌落数 （2）原理： 1个菌落1个活菌,研究思路,（二）统计菌落数目： 1、活体计数法（稀释涂布平板）（3）统计原则 选 30300 个菌落的平板统计 每个稀释度取3个平板取其平均值,为什么？,研究思路,例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,研究思路,甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值,研究思路,（4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此统计结果一般用菌落数表示。 每克样品中的菌株数=（C/V)* M C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。,为什么？,2、显微镜直接计数,研究思路,研究思路,利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。 1、A同学筛选出150个菌落。 2、B同学筛选出50个菌落。 B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。,研究思路,设置对照同等条件下，培养空白培养基,（三）设置对照 1、设置对照的目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 对照实验是指除了 被测试 的条件外，其他条件都 相同 的实验。满足该条件的称为 对照组，未满足该条件的称为 实验 组。,实验过程,（一）土壤取样 1、天然培养基和合成培养基： 2、土壤取样： （1）取样的位置： 土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中7090是细菌。在富含有机质的土壤层的38cm处中分布着绝大多数的细菌。 （2）取样要求：铲去表层土。,实验过程,（二）样品稀释 （1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液 （2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液 （3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液原则：确保平板上的菌落数在30300之间。,（三）微生物的培养与观察 1、接种：用适当的稀释液作涂布平板 2、培养：细菌：3037，12d; 放线菌:2528, 57d; 霉菌: 2528, 34d. 3、观察：a.每24h统计一次菌落数目 b.以“稳定菌落”为观察对象,实验过程,（四）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物的生存 酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性,实验过程,(1)作样品系列稀释液 (2)用适当的稀释液涂布平板,实验过程,在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。,实验过程,结果分析与评价,特别提示(1)不同细菌的菌落在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面的特征不同，可以作为菌种鉴定的重要依据。(2)进行活菌计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。(3)选择培养基一般只生长具有特定代谢特性的微生物，鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的微生物。,结果分析与评价,【例1】 尿素是一种重要的农业肥料，但若不经过细菌分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题。,微生物的分离,(1)培养基中加入尿素的目的是筛选_，这种培养基属于_培养基。,(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的_和_，实验需要振荡培养，原因是_。(3)转为固体培养基时，常采用_的方法接种，获得单菌落后继续筛选。(4)下列材料或用具：培养细菌用的培养基与培养皿；玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管；实验操作者的双手。其中需要灭菌的是_；需要消毒的是_。(填序号),(5)在进行分离分解尿素的细菌的实验时，A同学从培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。A同学的实验结果产生的原因可能有_。(填序号)由于土样不同 由于培养基污染由于操作失误 没有设置对照思维导图：,深度剖析(1)培养基中加入尿素的目的是筛选尿素细菌。(2)尿素可为尿素细菌提供氮源，震荡可为目的菌株提供氧气。(3)在固体培养基中接种常用稀释涂布平板法和平板划线法。(4)操作器械需灭菌，操作者双手需消毒。(5)土样不同、培养基污染、操作失误均可能导致计数误差。答案(1)目的菌选择(2)尿素葡萄糖为目的菌提供氧气(3)稀释涂布平板(平板划线)(4)和(5),思维拓展(1)利用选择培养基设计实验分离纯化微生物。真菌：用含青霉素的培养基分离。金黄色葡萄球菌：用含高浓度食盐水的培养基分离。固氮微生物：用无氮培养基分离。自养型微生物：用含无机碳源的培养基分离。光合细菌：用含无机碳源的培养基在无氧而有光照的环境中分离。厌氧型和兼性厌氧型微生物：用普通培养基在无氧条件下分离。,乳酸菌：用乳酸含量较高，pH较低的普通培养基分离。假单胞杆菌：用石油作为唯一碳源的培养基分离。(2)微生物分离与计数中两种对照组的作用：判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。,【例2】 下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述中，错误的是()。A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上C将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448hD确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数,微生物的计数,思维导图：深度剖析确定对照组无菌后，选择菌落数在30300的平板进行计数，D错；A是培养基的灭菌方法，B设置了一系列对照实验，C是细菌的培养方法，A、B、C三个选项均是正确的。答案D,旁栏思考题1想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？答案统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上的菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。,2为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？答案这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中，好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不相同。,练习(教材P26)1提示菌落是单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞的群落。可以通过稀释涂布平板法计算活菌的数目，其原理是