细胞培养实用操作

细胞培养cell cultivation 1665年植物学家罗伯特 .琥克第一次引入“ 细胞 ”概念， 1906年诺贝尔医学生理学奖授于关于细胞生物学研究、 N.S结构研究方面的工作 Golgi与 cajal。 1907年开始组织培养工作。 1925年 wilson提出 解决生物学问题的关键最终将在细胞中寻找到 。随着科学的发展及技术进步，从事生物医学研究的学者越来越迫切地认为 利用细胞生物学技术解决实际工作中所遇到的问题是非常必要的 ，它对任何生命科学实验都是必不可少的。 细胞培养的概念：指从体内取出组织后，分离的细胞在模拟体内生理环境等特定的条件下进行孵育培养，使之生存、生长，并维持其结构和功能的方法。一 细胞培养的优点及缺点：（一） 细胞培养的优点 ：1 研究的对象是活的细胞 ：可评定细胞形态结构、生理功能、生化特征，它是其他方法无法取代的。2 研究的条件可人为控制 ：可控制 pH、 T、 O2张力、 CO2张力等物理条件，同时也可施加化学、生物等因素作为条件而进行实验、观察。这些因素可严格控制。3 研究的样本可以达到比较均一性、重复性好：如细胞株则可达到均一性，而且纯化。4 研究的内容可以便于观察 、 检测和记录 ：倒置显微镜及光镜可观察细胞形态、电镜可以观察细胞超微结构；同位素标记、放射免疫、免疫组化可检测细胞内物质合成、代谢、定位；流式细胞仪可检测细胞周期、细胞表面抗原（鉴定细胞性质）、凋亡等；PCR检测；自动酶标仪检测等等。5 研究的经费相对较经济 。 6 研究范围比较广泛 ：细胞学、免疫学、肿瘤学、生化学、组织胚胎学、遗传学、分子生物学等。 可用于以下研究： 细胞与细胞之间相互作用 ：细胞间粘着、侵袭、接触抑制等。 细胞内部与细胞外界之间作用 ：细胞对外界刺激（药物、化学试剂、物理因素、生物因素等）反应，细胞内产物的改变。 细胞内胞质的活动 ：能量代谢及蛋白质合成变化。 胞质与胞核之间的流动 ：RNA自胞核至胞质，胞质激素受体复合物易位至核等。（二） 细胞培养的缺点 ：与体内条件存在差别，长期体外培养可使细胞形态、功能都发生一定程度的改变。 二 细胞培养条件 ：1 细胞培养所需设备 ：细胞培养室（超净工作台、倒置显微镜、CO2孵育箱、离心机、冰箱等）；清洁室（浸泡 玻璃器皿的清洁液、浸泡塑料和橡皮制品的 0.5 HCl 和 1 NaOH、蒸馏水、烤箱等）。2 无菌技术 ：工作环境的无菌处理（紫外线照射）、细胞培养所用器材的无菌处理（高压消毒或紫外线照射）、实验者的无菌操作技术等。 防止微生物污染 （ 细菌 、 霉菌 、 黑胶虫 ）。 3 培养液 ：基本的细胞培养液由 必需氨基酸 、 维生素 、无机盐 、 葡萄糖 、 血清 （内含血浆蛋白、肽类、脂肪、生长因子、激素、贴壁因子等）等组成。一般常用 RPMI1640、 DMEM、 F12、 M199等粉剂，用三蒸水配成液体，内加入 NaHCO3及二抗 10万/L，调整 pH7.2-7.4，除菌（孔经 0.22m ），分装保存、备用；应用时需加入新生（或胎）牛血清。细胞培养时还需配制除菌的 PBS液、Hank s液、胰酶等备用。三 培养中的细胞系生长方式 ：1 悬浮生长细胞 ：细胞不贴壁，常呈圆形。培养细胞离心沉淀，再悬于新培养液中计数，调整细胞浓度为 510 4-510 5个细胞 /ml。如白血病细胞。2 贴壁生长细胞 ：细胞贴壁，常呈多角形或梭形。倾去培养液、用 0.25胰蛋白酶或 0.1胰蛋白酶 0.02 EDTA消化、终止消化、离心去上清、再悬于新培养液中计数，调整细胞浓度为 510 4-110 5个细胞 /ml。如实体瘤细胞。 胰蛋白酶浓度太高可造成细胞裂解和活力的丧失。 EDTA的作用是增加细胞分离，加强胰酶的作用。有时可用除菌的 PBS液 Hanks液、生理盐水洗细胞。细胞计数 ： 用台盼蓝染料拒染试验进行血细胞计数器计数法：4个大格之和 4210 4个细胞 /ml四 细胞的冻存与复苏 ：1 细胞的冻存 ：收集细胞，加入冻存液（悬浮生长细胞 510 6-107/ml, 贴壁生长细胞 310 6-510 6/ml），采取分步的方式达到临界冻存点： 4-45 ， -20-45 ，液氮罐气态45 ，进入液态保存（也可 -80 低温冰箱保存）。采取分步的方式达到临界冻存点使细胞内部不能形成冰晶和抑制水外流。冻存液配制 ： DMSO、甘油是细胞保护剂，防止细胞内冰晶形成。20血清、 10 DMSO、 70 1640培养液；或 90血清、 10 DMSO，更可防止细胞内冰晶形成。2.细胞的复苏 ：应快速融化，并加入培养液，离心，去上清液，加入新培养液置于培养瓶中培养。五 肿瘤细胞培养 ：肿瘤细胞的培养是研究癌变机制和肿瘤细胞生物学特性的极好手段。（一）它有以下 优点 ：1可免受体内因素的影响，从而便于探 索各种物理、化学和生物等因素对瘤细胞生命活动的影响。2便于研究肿瘤细胞的结构与功能。 3可长期保存，便于观察细胞遗传性行为。4可用于快速筛选新抗癌药物（ 初筛新抗癌药物疗效 、 抗癌谱 、 可能的抗癌机制等 ）。5可用于细胞杂交，制备单克隆抗体。6研究周期短、比较经济。除肿瘤细胞株传代培养外，实体瘤（原发、转移灶）、癌性胸腹水、血液（外周血、骨髓血）均可在体外作原代培养。（二） 缺点 ：长期在体外培养，可使肿瘤细胞的生物学特性发生改变，如在北京、济南、武汉三处检测同一 H22细胞株内的蛋白质含量均不尽相同。 （三） 肿瘤细胞株的培养 ：肿瘤细胞株可分为 悬浮（血液肿瘤）与贴壁（实体肿瘤）细胞。在体外 传代培养 生长， 它们的生物学特性稳定，试验结果重复性好。 （四） 肿瘤原代细胞的培养 ：肿瘤患者的实体瘤（原发或转移）、癌性胸腹水、外周血、骨髓血均可进行原代细胞的培养。1肿瘤组织标本无菌获取，胸腹水、外周血、骨髓血均应该无菌、抗凝。2分离肿瘤细胞：采用机械粉碎或酶消化法，分散细胞；用密度梯度离心或反复贴壁法分离杂细胞。3接种于培养瓶内培养。 六 正常组织细胞原代的培养 ：（一） 新生组织细胞原代的培养 ：神经原、血管内皮细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成纤维细胞、肠上皮细胞等。（二） 一般组织细胞原代的培养 ：角膜上皮细胞、晶体细胞、结缔组织等。正常组织可用机械粉碎、酶消化或组织块培养。（三） 血液细胞原代的培养 ：无菌外周血抗凝，密度梯度离心，生理盐水洗涤，计数，培养。注意 ：无菌，细胞分离纯度，细胞应用的特殊培养基、胎牛血清，细胞培养在塑料培养瓶或 6孔、 24孔塑料板内。实验检测 ：细胞株药物 疗效、变化与机制1.药物作用效果 ： MTT法检测抑制率（量效与时效），求出中效浓度（ IC50） (定实验用量 )。2.绘制生长曲线 ：计算群体倍增时间（ TD ）。3.流式细胞仪检测 ：细胞周期变化