生物信息实验报告4(四)多序列分析及系统进化树构建.doc

（四）多序列分析及系统进化树构建实验目的：掌握多序列比对、构建系统进化树的基本步骤，熟悉使用CLUSTALW、MEGA5.1等软件的使用。实验内容：1、利用CLUSTALW工具进行多序列比对，学会参数设置，结果输出。将本实验室获得的仿刺参EGFR基因氨基酸序列，搜索同源序列，保存序列进行比对。2、利用MEGA5.1构建系统进化树，并用自展分析对进化树进行评估。实验步骤：1、将仿刺参EGFR基因氨基酸序列使用在线NCBI工具，进行Blast同源性比较见表1。NCBI上做Blast/blast/Blast.cgi找到相似度最高的几个序列，通常把序列（Fasta格式文件）下载下来，或点击GenBank登录号，复制FSATA格式，整合在一个*.txt文档中（单独建立一个文件夹存放，后面的很多文件会自动装入该文件夹），如XXXXAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAGCGAGGGTGCTTGCACCTTAGCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGCC表1氨基酸序列的同源性比对物种（Species）GenBank 登录号(GenBank Accession No.)相似性(Similarity)Anopheles gambiaeCAC35008.147%Nasonia vitripennisXP_00160283049%Xiphophorus xiphidiumAAP5567346%Camponotus floridanusEFN6098949%Danio rerioNP_91940547%Drosophila melanogasterAAR8524549%Gryllus bimaclatusBAG6566648%Xenopus (Silurana) tropicalisXP_00293996047%Lymnaea stagnalisABQ1063446%Gallus gallusNP_99082847%Rattus norvegicusEDL97896.147%2、 仿刺参EGFR氨基酸序列通过GENBANK数据库比较，经CLUSTAL W多重序列比对分析（图1）（注：图为部分比对序列图）。3、应用MEGA5.1软件在Bootstrap置信值为1000的条件下构建同源关系树 (图2)。在同源关系树中，直观的显示了仿刺参EGFR基因与其他各物种之间的相互关系。由同源树可已看出，仿刺参EGFR序列自聚为一支，在分子进化地位上与其生物学分类一致，因而得到的关系树反映了上述物种进化关系的远近。 图1 仿刺参与其他物种的EGFR氨基酸序列比较注：“*”表示相同氨基酸，“：”“”表示相似氨基酸，“-”表示此位置缺失氨基酸A Camponotus floridanus Nasonia vitripennis Gryllus bimaculatus Drosophila melanogaster Anopheles gambiae Lymnaea stagnalis Xiphophorus xiphidium Danio rerioXenopus tropicalis Rattus norvegicus Gallus gallus Apostichopus japonicus100100991008910099971000.1图2 根据EGFR氨基酸序列构建的系统进化树注：用MEGA5.1软件Njboostrap方法构建，分支上的数字代表boostrap值具体操作步骤如下：点击File/load sequences，将整理好的*.txt序列文件导入clustalx1.83，如图接着点击Alignment/Do Complete Aligment程序自动运行，得出结果，自动输出*.aln 和* .dnd 为后缀的两个文件，并自动存入你*.txt文件所在的文件夹内。序列比对也可以直接用MEGA来做。4、运行程序MEGA 5.1，如下图所示： 点击：File导入Clustal程序得到的*.aln文件。再点File/Convert to MEGA Format，打开转换文件对话框，从目的文件夹中选中Clustal 对比分析后所产生的*.aln文件，转换为*.meg文件。转换时一路确认相关界面。最后查看meg序列文件最后是否正常，命名新文件存盘保存*.meg文件，*.meg文件会和aln文件保存在上述*.txt同一个文件夹中。点击OK键，新建文件名*.meg，然后保存。5、 关闭转换窗口，回到主窗口，现在点面板上的“Data ”打开刚才的*.meg文件。 如果为蛋白质序列，选择“Protein sequence”，点击“OK”，得到以下图示。 选择默认的Standard，点击OK后，如图所示。点击程序中的，可以得到下图在另外一个窗口内，出现以下数据文件点击选择和编辑数据分类图标， 可对所选择的序列进行编辑，完成后点击close即可。另外，通过点击“C”“V”“Pi”“S”可以分别看到序列的保守区、可变区、最大简约信息位点、单序列位点变异。序列编辑完成后，可进行保存，点击保存后出现以下界面，点击ok即可。 用Bootstrap构建进化树，MEGA的主要功能就是做Bootstrap验证的进化树分析， 具体构建过程如下 参数的设置：点击，选择该菜单中的Construct/test Neighbor-Joining tree，选择前面转换得到的*meg文件，对下图的参数进行设置：说明：系统进化树的测试方法Test of Phylogeny，通常要选择Bootstrap method，也可以选择不进行测试；重复次数No. of bootstrap Replications通常设定至少要大于100比较好，随机数种子可以自己随意设定，不会影响计算结果。一般选择500或1000。Model/Method通常选择Kimura 2-parameter。设定完成，点compute，开始计算得到进化树构建的结果。如下图所示；该窗口中有两个属性页，一个是原始树Original tree，一个是bootstrap验证过的一致树Bootstrap concensus tree。树枝上的数字表示bootstrap验证中该树枝可信度的百分比。得到构建的进化树后可以对该进化树进行优化。(2)保存成到word文档中：点击下图中的Image,选择子菜单中的Copy to Clipboard.然后在Word中粘贴即可。 (1)利用该软件可得到不同树型，如下图所示： 除此之外，还可以有多种树型，根据需要来选择。 ）显示建树的相关信息：点击图标i。 ）点击优化图标，可进行各项优化： Tree栏中，可以进行树型选择：rectangular tree/circle tree/radiation tree。每种树都可以进行长度，宽度或角度等的设定 Branch：可对树枝上的信息进行修改。 Lable：可对树枝的名字进行修改。 Scale：标尺设置 Cutoff：cut off for consensus tree。一般为50%。 9、进化树的分类优化 Place root on branch：可以来回转换。 Flip subtree：180度翻转分枝，名字翻转180度。 Swab subtree：交换分枝，名字不翻转。 Compress/ex