葡萄糖耐量的试验

实验目的,掌握测定血清葡萄糖浓度的原理掌握血糖变化的临床生理意义掌握口服葡萄糖耐量试验的原理，适用人群和临床意义。,临床上OGTT主要适用于下列情况：（1）无糖尿病症状，空腹血糖异常，或偶尔出现糖尿，或有明显糖尿病家族史者；（2）有糖尿病症状，血糖水平不够糖尿病诊断标准者；（3）妊娠期或甲状腺功能亢进出现糖尿者；（4）不明原因肾病与视网膜病者。,实验原理,葡萄糖耐量试验（OGTT）是一种葡萄糖负荷试验，用于检查人体胰岛素B细胞功能和机体对糖的调节能力。正常人进食后血糖都会暂时性升高，3060分钟后可升到最高峰，但一般不超过8.9mmol/L，2小时左右又会回到空腹水平。这种现象称为耐糖现象。若内分泌失调或神经系统功能紊乱，则调节功能失常，食入大量糖后血糖浓度可急剧上升，短时间不能恢复到原值，称为耐糖失常现象。所以观察耐糖现象可以了解调节血糖的各种机能是否健全。,血清葡萄糖浓度测定方法1、GOD-POD法：以过氧化物酶作指示酶的偶联酶反应定量法。葡萄糖氧化酶（GOD）利用氧将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，同时释放过氧化氢。过氧化物酶（POD）催化过氧化氢氧化色素原（如4-氨基安替比林和苯酚），并使色素原氧化成色素，即Trinder反应。红色醌类化合物的生成量与葡萄糖含量成正比。,反应方程式：,GOD 葡萄糖+O2+H2O 葡萄糖酸+2H2O2 POD2H2O2+4-氨基安替比林+苯酚红色醌类化合物,葡萄糖氧化酶法是利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖产生葡萄糖酸和双氧水的反应而建立。血糖的酶法测定是利用酶的特异性催化而建立起来的，具有高度的特异性，同时，可以避免使用化学方法中的一些有害试剂等。操作过程简便，便于自动化检测,2、邻甲苯胺法：葡萄糖为一含醛基的己糖，在酸性条件下加热，可脱水生成5-羟甲基-2-呋喃甲醛，后者与邻甲苯胺缩合成青色的Suchiff碱。 Suchiff碱颜色的深浅与样品中葡萄糖的含量成正比与进行同样处理的标准葡萄糖液相比较，即可求出样品中葡萄糖的含量。由于邻甲苯胺只与醛糖作用显色，故此种测定方法不受血液中其他还原物质的干扰，测定时也无需除去血浆或血清中的蛋白质。,反应方程式：,H+葡萄糖5-羟甲基-2-呋喃甲醛+3H2O 加热5-羟甲基-2-呋喃甲醛+邻甲苯胺Schiff碱+H2O 青色,3、其他方法举例 福林马尔露斯（Folin-Malmors）超微量法：在热碱溶液中的葡萄糖可将高铁氰化钾还原为低铁氰化钾，后者再与硫酸高铁盐作用生成亚铁氰化铁（普鲁士蓝），与同样处理的葡萄糖标准液进行比色，即可求出血糖含量。 其反应如下：,血糖测定方法归纳,血糖的测定方法按测定原理可分为无机化学方法、有机化学方法和生物化学方法三类。此外，还有固相酶法、电化学法及质谱法等。常用的是分光光度法和酶学方法。分光光度法中常见的是邻甲苯胺法，是利用葡萄糖在加热的有机酸溶液中与某些芳香族胺类，可生成有色衍生物这一原理建立的。酶学方法有葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法和葡萄糖脱氢酶法等。(己糖激酶法)原理是用已糖激酶催化葡萄糖同ATP反应，产生葡萄糖6磷酸及ADP，葡萄糖6磷酸在葡萄糖6磷酸脱氧酶存在时，同NADP作用产生NADPH及6磷酸葡萄糖酸内酯，NADPH在340nm有吸收峰。,应用邻甲苯胺法测定血糖浓度来检测葡萄糖耐量,实验试剂：,1邻甲苯胺试剂邻甲苯胺为略带黄色的油状液体，易氧化，配置时易重蒸馏，收集199201时无色或浅黄色的馏出液。取硫脲2.5g，溶解于750mL冰醋酸中，再将此溶液移入1000mL容量瓶，加邻甲苯胺150mL、2.4%硼酸100mL，然后加冰醋酸至刻度。212mmol/L苯甲酸溶液 称取苯甲酸2.5g，加入蒸馏水1000ml,加热助溶，冷却后储存于试剂瓶中。 3.葡萄糖标准贮存液（10mg/mL）准确称取无水葡萄糖1.0000g,用饱和苯甲酸溶液溶解，移至100ml容量瓶中，稀释至刻度。 4葡萄糖标准应用液（1mg/mL） 用饱和苯甲酸溶液将葡萄糖标准储存液溶液稀释10倍。,实验步骤：,受试者前三天正常饮食，停用影响血糖的各种药物，如胰岛素、肾上腺皮质素、儿茶酚胺等。试验前1天晚餐后即不再进食（即空腹1014小时）。次日清晨空腹抽静脉血2ml（称为空腹血浆血糖，即FPG），然后将75g葡萄糖溶于200 300ml温开水中（儿童按每千克体重1. 75g），令受试者5min内服 下。服后0.5小时、1小时、1.5小时、2小时各抽一次血，取七支试管按下表操作：,测定血清中血糖浓度方法：取三支试管，按表操作,混匀，置沸水浴中煮沸15分钟，取出冷却后用分光光度计在波长630nm处，以空白调零，读取标准管和测定管的吸光度。,计算公式：,应用GOD-POD法测定血糖浓度来检测葡萄糖耐量,实验器材与试剂：,器材：5ml移液管50或100ul微量可调式移液器721E分光光度计1cm比色皿37恒温水浴,试剂：1、0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0） 称取无水磷酸氢二钠8.67g及无水磷酸二氢钾5.3g溶于蒸馏水800ml中，调pH7.0，定容至1L。2、酶试剂 取过氧化物酶12000U，葡萄糖氧化酶1200U，4-氨基安替比林10mg，置4保存，可稳定存放3个月。3、酚溶液 称取重蒸馏酚100mg溶于蒸馏水100ml中，用棕色瓶贮存。4、酶酚混合试剂 将酶试剂及酚溶液等量混合，4可以存放1个月。,5、12mmol/L苯甲酸溶液 取苯甲酸1.4g，于800ml蒸馏水中加温助溶，冷却后加蒸馏水定容至1L。6、葡萄糖标准贮存液（100mmol/L） 称取已干燥恒重的无水葡萄糖1.802g，溶于约70ml 12mmol/L苯甲酸溶液中，以12mmol/L苯甲酸溶液定容至100ml。2h后方可使用。（防止氧化的作用 ，葡萄糖为单糖，含醛基，易氧化成羧基，加入苯甲酸，平衡向左移动 ）7、葡萄糖标准工作液（5mmol/L） 吸取葡萄糖标准贮存液5.00ml放于100ml容量瓶中，用12mmol/L苯甲酸溶液稀释至刻度，混匀。,实验步骤：,受试者前三天正常饮食，停用影响血糖的各种药物，如胰岛素、肾上腺皮质素、儿茶酚胺等。试验前1天晚餐后即不再进食（即空腹1014小时）。次日清晨空腹抽静脉血2ml（称为空腹血浆血糖，即FPG），然后将75g葡萄糖溶于200 300ml温开水中（儿童按每千克体重1. 75g），令受试者5min内服 下。服后0.5小时、1小时、1.5小时、2小时各抽一次血，取七支试管按下表操作：,混匀，置37水浴中，保温15min，在波长510nm处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。然后分别计算出葡萄糖浓度C0、C1、C2、C3、C4。计算公式: 血清葡萄糖（mmol/L）=（A测定/A标准）*5将各次血糖测定结果，与相应的时间绘制成糖耐量曲线图，以便进行分析。,注意事项：,实验前受试者应充分休息，避免体力活动，试验中亦不能吸烟、喝咖啡，以免影响实验结果。葡萄糖氧化酶对-D葡萄糖高度特异，溶液中葡萄糖约36%为型，64%为型。葡萄糖的完全氧化需要型到型的变旋反应。新配制的葡萄糖标准液主要是型，故需放置2h以上（最好过夜），待变旋平衡后方可应用。,葡萄糖氧化酶法可以直接测定脑脊液葡萄糖含量，但不能直接测定尿液葡萄糖含量。因为尿液中尿酸等干扰性物质浓度过高，可干扰过氧化物酶反应，造成结果假性偏低。因红细胞的酵解将导致测定结果偏低，建议测定样品以草酸钾-氟化钠做抗凝剂以抑制糖酵解。严重黄疸、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后再进行测定。,临床意义：,生理性高血糖可见摄入高糖食物后，或情绪紧张肾上腺素分泌增加时。病理性高血糖 （1）糖尿病：病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病患者。 （2）内分泌腺功能障碍：甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能及髓质功能亢进，引起的各种对抗胰岛素的激素分泌过多，或升高血糖的激素增多引起的高血糖，现已归入特异性糖尿病中。,（3）颅内压增高：颅内压增高刺激血糖中枢，如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等，引起血糖增高。（4）脱水引起的高血糖：如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖轻度增高。生理性低血糖：见于饥饿和剧烈运动。病理性低血糖：特发性功能性低血糖最多见，依次是药源性、肝源性和胰岛素瘤等。,临床判断：,正常耐糖量：空腹血糖6.1mmol/L，口服1小时内血糖值升高至最高峰，但不超过11.1mmol/L，2小时后血糖水平（2hPG）基本恢复空腹水平，即2hPG7.8mmol/L。各次尿液中均未检出糖。空腹血糖损害（IFG）：6.1mmol/LFPG7.0mmol/L，2小时后血糖水平7.8mmol/L。糖耐量减退（IGT）:FPG7.0mmol/L以及7.8mmol/L2hPG11.1mmol/L。,糖尿病：FPG7.0mmol/L,2hPG11.1mmol/L。耐量增加 见于肾上腺皮质功能减退患者，垂体前叶功能减退、甲状腺功能减退及胰岛素分泌过多。其曲线特征是：（1）空腹血糖值低于正常值；（2）服糖后不出现血糖高峰；（3）1小时内血糖即可恢复原值。,肾性糖尿，耐糖量曲线属正常，服糖后出现糖尿，此现