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荧光标记复合扩增试剂盒概述一、荧光标记复合扩增检测技术简介 DNA分析近十几年来才应用于法医学的鉴定，在这期间，DNA分型技术取得了两次重大突破。1985年，Jeffereys等学者建立了第一代分型技术DNA指纹技术，其本质是以DNA分子杂交为核心的限制性片段长度多态性分析，实现了物证鉴定由排除到认定的飞跃口。进入20世纪90年代，Mullis和Saiki等学者发明并改进的PCR技术被用于法医DNA分析，从而建立了以PCR为基础的第二代DNA分型技术。其本质是应用PCR技术扩增人类基因组DNA中高度多态性位点，扩增产物经过片段长度多态性分析或序列多态性分析研究不同个体间DNA分子水平上的差异及其遗传规律。此技术一经出现，便在个体识别亲子鉴定中发挥了重要作用。经过近十多年的发展，法医DNA分析已建立了DNA指纹技术，PCR扩增片段长度多态性分析技术和线粒体DNA测序等三大主要技术，结合在它们基础上发展出的一些新技术方法，如小卫星重复单位多态性分析(PCRMVR)、单链构象多态性分析(PCRSSCP)、等位基因特异性引物PCR扩增(PCRSSP)等，共同形成了目前的法医DNA分析技术。 在一个PCR体系中同时扩增多个基因座的方法叫做复合扩增(multiplexing PCR)。单个基因座等位基因数量少，信息量有限，如果多个基因座扩增条件基本相似，就可以将多个基因座的引物加入一个扩增管中进行复合扩增，一次电泳检测，可在短时间内获得多个基因座的分型结果，提高单次检测的信息量，提高个人识别率，也可降低成本和检材的消耗，减少操作强度，对微量检材的鉴定特别有价值，有利于复核鉴定。 STR荧光标记检测技术是指将荧光染料标记到其中一个引物(一般选正链)的5端,使随后的每一个PCR扩增产物都带有一个荧光染料分子。这种带有荧光分子的DNA片段在电泳时从阴极向阳极电泳迁移,迁移速度按片段分子量由小到大排列,当片段通过到阳极端的激光扫描窗口时,荧光染料分子的共辄双键受到激发,发出一定波长的荧光,被扫描仪CCD接收,每一个带荧光染料的DNA片段按各自通过激光扫描窗口的实际时间(real time)被记录下来,出现一个荧光吸收峰,以荧光峰来表示每一个片段,峰值高低与扩增片段数量呈正相关,而峰出现的时间与片段大小呈正相关,片段小,出现峰时间短。根据同一泳道内标准分子量(简称为内标)的迁移率得到每一泳道迁移率的标准曲线,计算出待测样品的分子量大小,应用ABI 3130XL型基因分析仪片段分析精确度可达0.5bp。利用片段分析软件将测定的样品片段大小与同-一批加样的等位基因标准物(ladder)的片段大小比对,进行基因型命名(图1为荧光标记复合扩增检测技术原理)。因此,这种复合检测体系可以同步检测多个STR基因座,该检测体系可以根据等位基因片段所带的劳光颜色不同加以区别,即使等位基因片段长度有重叠的基因座,也可采取不同的荧光标记,区分不同基因座的等位基因。目前STR检验主要应用多色荧光标记复合扩增毛细管电泳自动检测技术。图1 荧光标记复合扩增检测技术原理应用基于荧光标记复合扩增结合毛细管自动电泳技术而幵发的各种商业化试剂盒,是目前法医STR检验的主要技术手段。目前，国内外用于生物检材个体识别检验、亲子鉴定和构建DNA数据库的商品化STR复合试剂盒主要有：IdentifilerTM、SINOfiler（美国ABI公司）、PowerplexTM16（美国Promega公司）、DNATyperTM15 plus（公安部物证鉴定中心）、Goldeneye16A（北京基点认知技术有限公司）、AGCU（无锡中德美联生物技术有限公司）。它们最多可获得18个常染色体STR基因座的分型结果。二、法医DNA鉴定常用试剂盒1、Applied Biosystems公司（美国）： Identifiler PCR扩增试剂盒英文名称：AmpF/STR Identifiler PCR Amplification Kit产品概述 AmpF STR Identifiler PCR扩增试剂盒可以在单次PCR反应中同时扩增15个STR基因座和Amelogenin性别基因。Identifiler试剂盒中进行复合扩增的四核苷酸位点包括CODIS所必需的13个核心STR位点，即CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、和vWA。获得的数据可以满足ENFSI（欧洲法医学网）与Interpol（国际刑警组织）的要求。另外两个四核苷酸位点（D2S1338与D19S433）与先前同FSS（英国法庭科学服务机构）联合开发的SGM Plus扩增试剂盒相一致。相比之前所有的AmpF STR试剂盒，包含了上述STR位点的Identifiler试剂盒是功能最强大的一个试剂盒。6-FAM dye: CSF1PO, D7S820, D8S1179, D21S11VIC dye: D2S1338, D3S1358, D13S317, D16S539, TH01NED dye: D18S51, D19S433, TPOX, vWAPET dye: Amelogenin, D5S818, FGA特点：（1）单管同时扩增16个位点，包括15个STR个体识别位点以及一个性别鉴定位点Amelogenin（2）实验流程简单，一个反应管，一次进样，一个泳道分析（3）采用与其他试剂盒完全相同的引物序列，不同试剂盒的结果具有可比性（4）五色荧光技术，在维持扩增产物大小不变的条件下，有效提高了单个泳道分辨的片段数（5）最大扩增产物小于350碱基，扩增容易，峰高均一（6）提供完整的解决方案，由试剂、仪器、软件、技术支持等构成完整的体系2、Yfiler PCR扩增试剂盒英文名称：AmpF/STR Yfiler PCR Amplification Kit产品概述 AmpF STR Yfiler PCR扩增试剂盒是一种能在单个PCR反应中复合扩增Y染色体上的17个STR基因座的STR分析试剂盒。该试剂盒包含了被定义为欧洲小单倍型的核心基因座，以及由DNA分析方法科学工作组（SWGDAM）所推荐的位点和另外六个高度多态性基因座，提高了Yfiler试剂盒单倍型分析的识别能力。特点：（1）单管同时扩增17个Y染色体STR位点（2）试验流程简单，一个反应管，一次进样，一个泳道分析（3）五色荧光技术，有效提高了单个泳道分辨的片段数（4）最大扩增产物小于350碱基，扩增容易，峰高均一（5）不和女性DNA反应，适用于混合斑等检材的检验（6）灵敏度高，在混合样品中含有多量的女性DNA也可测到男性的基因型在男性家系排查和亲缘关系分析中有独特的作用3、STR MiniFiler PCR扩增试剂盒英文名称：AmpF/STR MiniFiler PCR Amplification Kit产品概述：STR MiniFiler PCR扩增试剂盒是世界上第一个为法医案件样本设计的商品化小片段STR扩增试剂盒.通过革新引物设计,改进PCR扩增条件和优化缓冲体系,MiniFiler 试剂盒可以提供更灵敏,更完整的DNA分型结果.与其他AMPF STR系列的试剂盒相比,MiniFiler试剂盒更能提高疑难案件样本的识别能力,从而使更多涉及犯罪和失踪人员的案件得以解决.包含Identifiler试剂盒中片段最大、最难扩增的8个基因座：D13S317、D7S820、D2S1338、D21S11、D16S539、D18S51、CSF1PO和FGA，同时含有Amelogenin基因座，可以进行性别检验。特点：（1）使用五色荧光标记技术（2）能克服法医学样本中常见的抑制物如血红素和腐殖酸的影响（3）能补充AmpF STR Identifiler,Profiler Plus,Profiler Plus ID,Cofiler,Sefiler和SGM Plus PCR（4）试剂盒扩增所丢失的信息，使得原本扩增失败或等位基因丢失的大片段基因座得到检验（5）低至125pg的模板DNA也能获得完整的分型图谱具有较高的个体识别能力（6）对于陈旧骨骼、腐败样本和其它困难生物检材有独特的作用（7）为疑难样本的STR扩增提供最佳结果。4、Sinofiler 16位点STR荧光检测试剂盒英文名称：AmpF/STR Sinofiler PCR Amplification Kit美国ABI公司根据中国人群的特点，开发研制了Sinofiler试剂盒,该系统与Identifiler体系相比,不再含有多态性不理想的THO1和TPOX两个基因座,而用D12S391、D6S1043基因座取而代之。特点：（1）单次PCR反应同时扩增15个STR基因座及Amelogenin性别基因（2）本试剂盒含有AmpF/STR Identifiler PCR扩增试剂盒所扩增的13个基因座，以及在中国人群中能提供较多信息的D6S1043 和D12S391基因座（3）利用强大的五色荧光染料标记DNA技术，能够最大化扩增所获得的遗传信息量，保持获得小片段的扩增子，减少样本消耗量以 及进行高通量分析（4）本试剂盒作为整体解决方案的一部分，专门针对中国法庭科学单位所研发的，该整体解决方案还包括便于培训和分析试验流程的简体中文版5、Profiler Plus ID 法医基因分析试剂盒产品概述:Profiler Plus ID法医基因分析试剂盒单管同时扩增10个位点，包括9个STR个体识别位点以及一个性别鉴定位点Amelogenin Profiler Plus ID法医基因分析试剂盒单管同时扩增10个位点，包括9个STR个体识别位点以及一个性别鉴定位点Amelogenin特点：（1）实验流程简单，一个反应管，一次进样，一个泳道分析（2）采用与其他试剂盒完全相同的引物序列，不同试剂盒的结果具有可比性。（3）最大扩增产物小于350碱基，扩增容易，峰高均一（4）提供完整的解决方案，由试剂、仪器、软件、技术支持等构成完整的体系6、Cofiler试剂盒 AmpF1 STR Cofiler试剂盒扩扩增6个STR位点，PCR产物经ABI Prism377序列分析仪电泳后，用基因扫描软件进行分析。6个STR位点：D2S1358、D16S539、TH01、TPOX、CSF1PO、D7S820 。主要用于亲子鉴定7、ProMega公司（美国）：PowerPlex 16 System荧光检测试剂盒英文名称：PowerPlex 16 System产品概述：包含CODIS系统13个基因座和PentaD、PentaE两个重复单元为5个bp的特别基因座同时含有Amelogenin基因座，可以进行性别检验。特点：（1）16个位点同时在一个管子中扩增，在单一凝胶泳道中进行分析（2）能与310、3130、3130XL等各类测序仪配套使用（3）低至1ng的模板DNA能获得最佳检测效果，0.5ng的模板能获得可重复结果（4）试剂盒包含荧光内标和等位基因标准ProMega公司（美国）：PowerPlex 16HS系统产品概述： 可以进行16个基因座（15STR位点和1个性别位点）的复合扩增并用三色荧光进行检测。系统内的基因座包括，Penta E,D18S51,D21S11,TH01,D3S1358,FGA,TPOX,D8S1179,Vwa, Amelogenin,PentaD,CSF1PO, D16S539, D7S820,D13S317和D5S818.全部16位点在一管中同时扩增，然后通过单一泳道进行电泳分析。8、Typer 15 荧光检测试剂盒（国产）产品概述：更符合中国人群遗传特征：独创的基因座组合方式和引物序列，保留了足够通用基因座，便于DNA数据的交流与共享，而且更加符合中国人群遗传特点。 特点：（1）单管同时扩增15个基因座，包括14个个体识别基因座及一个性别鉴定位点Amelogenin。（2）扩增产物小:全部15个基因座的PCR产物均小于400bp，扩增效率及重现性高。 （3）高效抗抑制物的缓冲液系统，优化的热循环参数与引物配比，提高了对DNA降解样品的扩增效率。 （4）解决了等位基因标准对照物容易降解的技术难题，实现了等位基因分型标准物的大量制备和稳定保存。 （5）高灵敏度和识别率。最低灵敏度为0.5ng。在中国汉族人群中的累积随机匹配概率为3.4910-18，累积非父排除率为 0.9999996。9、中德美联：AGCU（国产） AGCU 10+1 STR荧光检测试剂盒产品概述：采用多色荧光标记、多重PCR复合扩增方法对人基因组DNA中STR位点的多态性进行检测，通过分析扩增结果来确定血样、精斑、牙齿、骨骼、毛发、唾液等生物检材的基因型。AGCU 10+1 STR荧光检测试剂盒可以进行11个DNA位点（10个STR位点和1个性别位点）的同步扩增并利用四色荧光技术进行检测。本试剂盒包含的DNA位点有Amelogenin 、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D8S1179、D21S11、D18S51、VWA、D5S818、FGA。特点：（1） 该试剂盒采用先进的多色荧光标记、多重PCR复合扩增STR位点技术，并且完全选用国内外法医界所认同的STR位点，兼容相关法医学DNA数据库。（2） 该试剂盒也完全继承和发展了目前在法医界使用的同类产品的优点：联合分辨率高；等位基因扩增结果与其它产品同位点扩增结果完全一致；PCR扩增产物特异性高；PCR扩增效率及重现性高；PCR扩增灵敏度高；PCR产物电泳分辨率高；支持DNA部分降解样品的扩增；友善的客户界面，操作简单等等。基点认知（国产）：10、Goldeneye 20A试剂盒产品概述：Goldeneye20A，在CODIS13个核心基因座的基础上，增加了基因座Penta E、Penta D、D2S1338、D19S433、D12S391和D6S1043，采用五色荧光技术，一次性扩增19个STR基因座和一个性别基因座，兼容了当前DNA身份鉴定主流试剂盒的全部STR基因座，提供了历史数据的更大兼容性和更高准确度，提供了更多的信息量，满足单亲鉴定的需求，具有更高的非父排除率和个体识别率可以为您节省一半的工作量；减少了二次扩增的时间，省去了两个不同试剂盒的数据对比时间，检验速度提高一倍以上；节约30%以上的检测试剂费用，减少不必要的成本支出。三、六色荧光标记复合扩增试剂盒优势及前景 如对犯罪现场生物检材进行个人识别的检测，以上试剂盒单独使用均能够解决问题；在大多数的标准三联体：母-子-疑父的亲子鉴定中，也基本能够满足要求。但是面临越来越多的单亲鉴定案件、祖孙鉴定案件、同胞鉴定案件，显然单独使用以上任何一个STR荧光复合试剂盒不够，需要检测更多的STR基因座才能解决这些特殊的亲权鉴定案件。此外，从美国血库协会(The American Association of Blood Banks，AABB)收集到的STR基因座突变数据看，几乎所有STR基因座均存在基因突变现象，严重影响是否存在亲缘关系的判断，必须增加STR基因座的检测数量。尤其值得注意的是，随着DNA数据库规模的不断扩大，为有助于更清楚地判别检索出来的匹配数据，特别是遇到一些具有亲缘关系的样本比对或同一认定复核时，也迫切需要引入更多的STR基因座, 提高检测系统效能十分有必要。 Life Technologies Corporation(美国生命技术公司，NASDAQ: LIFE)推出了GlobalFiler Express 试剂盒，这种新的 DNA 试剂盒将为全球犯罪实验室进行法医鉴定的方式带来革命性变化,使实验室可以更快、更容易地处理 DNA 样本，并减少处理样本方面的开支。通过将遗传标记种类的数量提升30%以上，使其达到24种，GlobalFiler Express 可以从法医鉴定样本中获取更多的信息，并将识别率提升8倍。这可以为解决鉴定问题带来更快、更强大的法医鉴定数据比对。结合比其他解决方案处理速度快5倍的效率，这种重要进步可以让法医鉴定科学家们在处理越来越多的延误问题的同时打击和预防更多犯罪。迄今为止，44个国家已经实施了罪犯 DNA 数据库计划，罪犯 DNA 样本的总数现在已经达到了4000万个，而且还在不断增加。 GlobalFiler 试剂盒组合包括用于参考样本处理的 GlobalFiler Express 试剂盒和用于处理个案证据的 GlobalFiler 试剂盒，该组合采用新的专属化学方法，可以在与 Life Technologies 的法医鉴定系统结合使用的时候支持2小时内处理48个样本，这个速度比现在市场上的其他解决方案的速度快出5倍。GlobalFiler 试剂盒还可以更快、更清晰地放大包括已经降解的人类遗骸在内的疑难样本。GlobalFiler的基因座选择 24个基因座的多重分析让鉴定能力比上一代的试剂盒高了9个数量级，试剂盒包含了CODIS CoreLoci Working Group (核心位点工作组)最新推荐：将“必要的核心位点”由原来的13个增加到20。此外，GlobalFiler Kit包含了10个mini-STR基因座，目前法医学主要运用常染色体STR基因座遗传标记，能够解决大部分个体识别和亲权鉴定案例。然而，在许多法医案例中，DNA样本由于各种原因而被高度降解或被混入环境污染物，在使用商品化STR复合扩增试剂盒进行检测时，片段较长的STR基因座往往无法进行有效的扩增，片段检测不到信号，而这个问题随着PCR反应产生大量的PCR产物而被扩大。miniSTR基因座分析技术在设计引物时，使其尽可能靠近核心重复序列而缩短扩增片段长度，用于高度降解的DNA样本检测可提高检测成功率。图2 GlobalFiler试剂盒包含基因座图3 GlobalFiler试剂盒选用的六色荧光 GlobalFiler试剂盒利用突破性的6-dye试剂，以实现最佳性能和前所未有的鉴定能力。六色荧光的优势: 如果把所有基因座都排在5色通道内就会比较拥挤出现以下几点缺憾：1、大片段基因座太多； 2、扩增子太长； 3、mini-STR 数量不可能太多； 4、基因座间距太拥挤；5、引物组（序列）的一致性成问题。采用六色荧光可以避免这些缺点，相比于五色荧光有以下几点优势：1、减少会出现在大片段区域 （ 400 bp) 范围内的基因座，这减少降解样品和疑难样品出现位点丢失的可能性；2减少引起判读困难，某些基因座的扩增子可能达到500 bp，降低低分辨率造成的判读难度。例如， 位点错标为OL或者难以区分微变异多态性；3、六色荧光可容纳更多的mini-STR(图5)；4、.相邻位点之间间距不够。太过拥挤则难以扩展marker对未知的OL的标记能力将下降，GlobalFiler Kit 的 Ladder 在9个 基因座上共增加了31个等位基因；5、最大程度减少从新设计引物带来的分型错误的风险数据一致性问题使用新引物序列带来的基因分型错误风险；图4 STR分析检测的发展图5 GlobalFiler Kits: mini-STR 的增强GlobalFiler试剂盒优势：1、24个基因座的多重分析让鉴定能力比上一代的试剂盒高了9个数量级包括10个强大的mini-STR位点，可从严重降解的样品中回收更多的信息（如图6所示）。2、增强的缓冲液系统让受抑制样品的表现出色 3、灵敏度和灵活性改善，样品起始量高达15 L，增加了低浓度样品的等位基因回收4、单一来源检材，扩增时间缩短至40分钟图6 GlobalFiler Kit 和. Identifiler Plus Kit骨样检测结果对比 GlobalFiler试剂盒的多重配置包括全部24个基因座，只有1个基因座部分超过400 bp。10个mini-STR位点完全低于220 bp，而所有的性别特异标记都位于绿色的VIC 通道，方便解释。GlobalFiler试剂盒的等位基因ladder包括343个等位基因，特有许多位点的扩展标记范围，同时维持了基因座间间隔。扩展分析板和虚拟箱最大限度减少OL等位基因检出，有利于更准确更高效的自动基因分型。 随着全球法医DNA数据库迅速扩展，人们也需要更具鉴定能力的STR多重分析，它们可最大限度地重叠位点。这也是GlobalFiler试剂盒包含尽可能多的常用基因座的原因所有都在单个多重分析上。GlobalFiler试剂盒包含全球主要数据库中所有常用的STR基因座，包括CODIS核心位点工作组建议列入的所有标记以及那些欧洲常用的标记降低了不定匹配的风险，同时实现了更有效的跨边界数据共享。参考文献：1王永在,荣辽江,欧拉.法医DNA检验的现状和发展J.刑事技术,2005,173(2):28-30.2胡娜，PCRSTR分型技术的研究发展，国外医学遗传学分册，2003，26（6）319-3233唐建新 ，李双琳等，Chinese Journal of Forensic Sciences，2013，N o1 Total N o664 刘宏. 24个Y-STR基因座荧光标记复合检测体系的建立及其法医学应用 D. 南方医科大学 , 2012.5姜先华, 贾 菲等. 五色荧光标记20 个基因座复合扩增体系及法医学应用J. 中国法医学杂志, 2012, 27(3):185-189.6严晓玲, 邹刚. 多色荧光STR 新位点在诊断染色体数目中 的应用研究J. 中国产前诊断杂志, 2011, 3(2):7-11.7刘宁,李淑瑾等.D3S3053, D6S474, D20S482, D1GATA113,D2S1776, D4S2408 miniSTR基因座四色荧光分型体系的构建及法医学应用D,河北医科大学，2008.8李英碧，吴瑾等.STR基因座荧光标记复合扩增检测及其法医学应用J.中国法医学杂志,2005,21(2):96-999李莉,陈光辉,李成涛等. 多色荧光STR检测试剂盒的研制与验证J . 法医学杂志, 2006, 22( 2) : 111-115.10王会品, 刘超, 孙宏钰. miniSTR 技术的研究进展. 法医学杂志，2006，22（2）：159-S111 Gill P，Fereday L，Moding N，et a1The evolution of DNA databases- recommendations for new European ST R loci fJ1Fo