圆二色光谱原理及在药化中的应用1-教案

手性光谱学原理及在药化中的应用,北京协和医学院 药物研究所圆二色谱实验室,2011年9月16日,1,什么是手性光谱学（Chiroptic/chiroptical Spectroscopy）？,2,Chiroptic/chiroptical: A term referring to the optical techniques (using refraction, absorption or emission of anisotropic radiation) for investigating chiral substances e.g. measurements of optical rotation at a fixed wavelength, optical rotatory dispersion (ORD), circular dichroism (CD), and circular polarization of luminescence (CPL).,3,手性化合物的绝对构型确定（Absolute configuration assignment）和构象分析（Conformation analysis）生物大分子的结构和功能研究材料科学。,手性光谱学能解决什么问题？,4,手性是自然界的普遍现象。天然产物、合成药物、生物大分子（蛋白质、核酸、糖）大多具有手性。,为什么要进行手性光谱学研究？,紫杉醇,五味子丙素,5,立体化学手性药物紫外光谱分子性质偏振光,一、基础知识,6,基础知识,光学活性（又称为手性，chirality）是指化学分子的实物与其镜像不能重叠的现象。,7,7,基础知识,分子的手性是由于分子中含有手性中心（Chiral center）、手性轴（Chiral axis）或手性面（Chiral plane）所致，非平面环状化合物则具有螺旋手性（Spiral chirality）。,8,基础知识,9,基础知识,在空间上不能重叠，互为镜像关系的立体异构体称为对映异构体。非对映异构体包括几何异构体和具有光学活性但没有镜像关系的立体异构体。,立体异构体（Stereoisomer）是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，可分为对映异构体（Enantiomer）和非对映异构体（Diastereomer, diastereoisomer）两大类。,10,基础知识,构象（Conformation）：由于分子中的某个原子（基团）绕C-C单键自由旋转而形成的不同的暂时的易变的空间结构形式，不同的构象之间可以相互转变。在各种构象中，势能最低、最稳定的构象是优势构象。,单键旋转引起,环的扭曲方向不同引起,11,基础知识,构型（Configuration）：因分子中存在不对称元素而产生的异构体中的原子或取代基团的空间排列关系。能真实描述手性分子中各取代基的空间排列情况被称为绝对构型（Absolute Configuration）。尚未能确定各取代基空间排列真实情况的构型被称为相对构型（Relative Configuration）。相对构型还包括同分子中各不对称碳原子间的相互关系，如同侧或异侧。,绝对构型的表示方法,左旋体（Levorotatory）和右旋体（Dextrotatory）,12,基础知识,能使偏振光的偏振面按顺时针方向旋转的对映体称为右旋体，用d-或(+)-表示；反之，称为左旋体，用l-或(-)-表示。外消旋体（Racemate）由等量的左旋体和右旋体构成，没有旋光性，用dl-或()-表示。这种表示方法，直观地反映了对映体之间光学活性的差别，但不能提供手性分子三维空间排列或绝对构型的信息。,以标准参照物的化学相关性确定药物的立体化学构型。标准参照物有糖类如D-甘油醛，氨基酸如L-丝氨酸。,13,基础知识,D和L系统,由于D/L构型表示法与表示旋光方向的d和l系统容易混淆，且意义不甚明确，目前多限于糖和氨基酸的立体化学命名。,将手性中心的取代基按原子序数依次排列，A B C D，把D作为手性碳原子的顶端，A、B、C为四面体底部的3个角，从底部向顶端方向看，若保持从大到小基团按顺时针方向排列者，称为R型；若为逆时针方向排列者，称为S型。,14,基础知识,R和S系统,15,对映体在对称的环境中，物理化学性质完全相同。但在非对称的环境中，例如在偏振光中，对映体对偏振光面旋转方向相反；在生物系统中与酶或受体相互作用时，由于蛋白质分子的非对称性，与对映体的识别方向和结合位点不同，导致生物活性的差异。非对映体之间，彼此属于不同结构的化合物，所以物理化学和生物学性质均不相同。,基础知识,16,临床药物1850种,天然和半合成药物523种,化学合成药物1327种,非手性6种,手性517种,非手性799种,手性528种,以单个对映体给药509种,以外消旋体给药8种,以单个对映体给药61种,以外消旋体给药467种,基础知识,17,基础知识,在分子水平上，生物系统是由生物大分子组成的手性环境。光学异构体进入生物体内，将被手性环境识别为不同的分子，从而表现出不同的药效学、药物动力学、毒理学行为。各国药政部门规定在申报手性新药时，需同时呈报各光学异构体的药理学、毒理学、药物动力学资料。如果对映体之间的药效与毒性无明显区别，才可考虑应用外消旋体，否则必须应用单一的手性化合物。我国药品管理法已明确规定，对手性药物必须研究光学纯异构体的药代、药效和毒理学性质，择优进行临床研究和批准上市。停留在外消旋体药物的研究与开发水平，已不符合国际与国内药品法规的要求。,18,基础知识,对映体有相同的药理活性,R和S型异构体的抗心率失常和对心肌钠通道作用相同，吸收、分布、代谢、排泄性质亦无显著区别，两者及外消旋体的综合评价结果相当，所以临床使用消旋的氟卡尼。,19,对映体活性类型相同但强度不同,基础知识,S-(-)-氧氟沙星抑制细菌拓扑异构酶II的活性是R-(+)-型的9.3倍，是外消旋体的1.3倍。对各种细菌的抑菌活性S型强于R型8128倍。左氧氟沙星已取代消旋氧氟沙星。,S-(+)-萘普生的抗炎和解热镇痛活性约为R-(-)-型的1020倍，因此，临床用其S-(+)-对映体。,20,基础知识,只有一个对映体有药理活性,(+)-联苯双酯,(-)-联苯双酯,由于联苯基存在阻转作用，形成两个阻转异构体，室温下可稳定存在。右旋体为活性体。,21,基础知识,对映体有不同或相反的药理活性,左旋咪唑（Levamisole）有驱虫和免疫刺激作用，而右旋咪唑（Dextramisole）有抗抑郁作用。,奎宁-奎尼丁（Quinine-Quinidine）两个异构体都有抗疟、解热、氧化毒性和骨骼肌及心肌抑制作用。奎宁主要用于解热和抗疟，奎尼丁对心肌作用更强，用于心房纤颤和其他心律不齐。,22,基础知识,在20世纪60年代出现的沙立度胺事件是药学史上的沉痛教训。,S-(-)-沙立度胺的二酰亚胺进行酶促水解，生成邻苯二甲酰亚胺基戊二酸，后者可渗入胎盘，干扰胎儿的谷氨酸类物质转变为叶酸的生化反应，从而干扰胎儿发育，造成畸胎。,23,基础知识,偶极矩（Dipole moment）是正、负电荷中心间的距离r和电荷中心所带电量q的乘积， = r q。它是一个矢量，方向规定为从负电荷中心指向正电荷中心。偶极矩的单位是D（德拜）。偶极矩可以指键偶极矩，也可以是分子偶极矩。分子偶极矩可由键偶极矩经矢量加法后得到。实验测得的偶极矩可以用来判断分子的空间构型。,偶极矩,24,生色团和助色团,基础知识,生色团（Chromophoric group）是指分子中含有的，能对光辐射产生吸收、具有跃迁的不饱和基团。通常表现为n*和*跃迁，因而吸收范围多在200800nm之间。助色团（Auxochrome group）是含孤对电子的基团，如氨基、羟基和卤素等。这些基团与生色团上的不饱和键作用，使颜色加深。,25,基础知识,光是一种电磁波横波,机械波穿过狭缝,26,平面偏振光（又称线偏振光）,基础知识,17世纪，Huggens，发现偏振光；1812年，Biot，发现石英能使偏振光的偏振面旋转；1934年，Lowry，旋光测定；1953年，制备了第一台偏振光检测仪；19世纪60年代以后，圆二色谱仪出现。,自然光-光振动沿各个方向均匀分布偏振光-光振动沿着特定的方向,27,基础知识,当只有一块偏振片时，以光的传播方向为轴旋转偏振片，透射光的强度不变。,当两块偏振片的透振方向平行时，透射光的强度最大，但比通过一块偏振片时弱。,当两块偏振片的透振方向垂直时，透射光的强度最弱，几乎为零。,28,基础知识,偏振光的应用：立体电影,两个摄像机 + 偏振片两个放像机 + 偏振片眼睛 + 偏振片,29,基础知识,左旋圆偏振光和右旋圆偏振光,振幅相同、周期相同，但运动方向相反,二、旋光光谱与圆二色谱测定原理,30,比旋光度旋光光谱圆二色谱Cotton效应,平面偏振光在手性环境中的传播特性,使平面偏振光的偏振平面发生偏转反映了手性化合物的圆双折射性,(1) 左旋、右旋圆偏振光的折射率不同 nL nR,31,ORD & CD原理,式中，是波长，nL和nR分别为左旋圆偏振光和右旋圆偏振光在介质中的折射率，的单位是rad/cm，的单位是/dm。,32,偏振平面所转过的角度可用下式计算：,ORD & CD原理, = (/)(nL nR), = 1800/ = (1800/)(nL nR),将的单位由rad转变为，即实验测定的旋转角度为：,33,(2) 左旋、右旋圆偏振光的吸收系数不同 L R,形成椭圆偏振光反映了手性化合物的圆二色性,ORD & CD原理,形成具有一定偏转角度的椭圆偏振光,34,ORD & CD原理,(3) 左旋、右旋圆偏振光的折射率和吸收系数均不同 nL nR，L R,35,圆二色性是摩尔吸收系数的差值，在手性介质中，,ORD & CD原理, = L R 0,椭圆度（）定义为：,tan = tanh(/)(L R)lcm),式中是吸收指数，l是光程长度，单位是/cm。,吸收指数与消光系数k的关系为：,由于(L R)lcm 1，可近似为：, = (/)(L R),k = (4/),吸收系数之差(L R)通常只是的10-2到10-4。,36,将椭圆度的单位由rad转变为，换算公式如下：, = (1800/)(L R) = (1800/4)(kL kR),摩尔椭圆度的计算公式如下：, = (/cl)(M/100),由于消光系数k = 2.303c，摩尔椭圆度的计算公式如下：, = 2.303(4500/)(L R) = 3300(),ORD & CD原理,37,比旋光度测定,仪器记录的是旋光率，计算公式为：D = /(lc)D 比旋光度，D: 589 nm l:池长，dmc: 溶液浓度，g/mL,常用光源：钠灯（589nm）汞灯（365nm、436nm、546nm、578nm）,比旋光度（Specific optical rotatory ）, D17 = + 213 0.3 （c= 5.77, 氯仿）,38,注意：一个手性化合物的比旋光度随测定温度、浓度、溶剂而变化，因此测定时应当注意选择与文献报告相同或相近的温度、相同的溶剂，以及配置相近浓度的溶液，否则难以比较。比旋光度的符号与该分子的绝对构型没有直接关系。,比旋光度报告形式：,比旋光度测定,旋光测定的应用,确定样品的光学纯度，用于工业生产过程对产品质量的检测。确定手性分子的绝对构型（某些类化合物已总结出一些经验性的结构与旋光性的关系规则）。测定不对称合成中的某种产物的光学纯度百分率或对映体过量百分率。,39,光学纯度百分率(%O.P.) = 观察 / 最大 X 100%对映体过量百分率(%e.e.) = (R - S) / (R + S) X 100 % = %R - %S,比旋光度测定,旋光光谱（Optical rotatory dispersion，ORD）,40,ORD图谱测定,以比旋光度或摩尔旋光度为纵坐标，以波长为横坐标，获得的谱线即为旋光光谱。,41,ORD图谱测定,旋光光谱是非吸收光谱，不具有紫外吸收的手性化合物也可测定ORD光谱。化合物无发色团时，对旋光度为负值的化合物，ORD谱线从紫外到可见光区呈单调上升；而旋光值为正的化合物是单调下降，这类ORD谱线称为正常的或平坦的旋光谱线。,42,ORD图谱测定,分子中有一个简单的发色团的ORD谱线，在紫外光谱max处越过零点，进入另一个相区，形成的一个峰和一个谷组成的ORD谱线。,Cotton效应（CE）：在接近所测化合物的紫外最大吸收波长处出现的异常S曲线。（法国Aime Cotton）,43,ORD图谱测定,44,ORD图谱测定,实际的ORD曲线是分子中各个发色团CE的加合结果。因此，ORD谱线常呈复杂情况。,45,CD图谱测定,圆二色谱（Circular dichroism，CD）,以摩尔椭圆度或吸光度差为纵坐标，以波长为横坐标，获得的谱线为圆二色谱。,摩尔椭圆度与吸光度差的换算关系为： 3300 ,46,ECD检测波长：175 900nm,=L-R = A / Cl = (dL-dR) / C l d 为光密度；C 为物质的量浓度 mol/L；l 为池长。,CD仪器记录椭圆偏振光的椭圆度（millidegrees，mdeg），文献报道通常使用摩尔椭圆度：= ()M/100lc c单位：g/mL，l单位：dm,CD图谱测定,47,CD图谱测定,48,光源：氙灯起偏器：Nicole棱镜（天然方解石）、Rochon棱镜（结晶状石英）调制解调器（CDM）：在其上施加几万赫兹的高频交变电压，作用是将单色的平面偏振光以这种频率交替地变化为左旋、右旋圆偏振光。光电倍增管（PM）样品池氮气保护装置,CD图谱测定,Cotton效应：平滑曲线在所测化合物的最大吸收波长处出现的异常峰状或谷状曲线。,49,CD图谱测定,CD光谱是吸收光谱，只有具有紫外吸收的手性化合物可以测定CD光谱。,紫外光谱、旋光光谱及圆二色谱的关系,50,Cotton效应,在化合物紫外最大吸收处，是ORD产生Cotton效应谱线跨越基线的位置；是CD产生Cotton效应谱线的位置。,51,Cotton效应,在紫外可见区域，用不同波长的左旋、右旋圆偏振光测量CD和ORD的主要目的是研究有机化合物的绝对构型或构象。在这方面，ORD和CD所提供的信息是等价的，实际上它们之间有固定的关系。 CD谱比较简单明确，容易解析。ORD谱比较复杂，但它能提供更多的立体结构信息。对于有多个紫外吸收峰的化合物，就会有多个连续变化的CD谱线和相应的ORD谱线。,52,CE是研究手性化合物绝对构型及优势构象的依据，有机手性化合物具有以下三种结构特点即可产生具有CE的CD图谱。,Cotton效应,含有结构不对称的生色团，如共轭的二烯类、,-不饱和酮类、六螺旋烃等，可研究骨架的立体化学。,53,Cotton效应,含有处于不对称环境中的结构对称的生色团，如酮基类、,-不饱和酮类、双键类、苯甲酸酯类、芳香化合物等，可研究手性中心的立体化学。,54,Cotton效应,含有两个或多个具有* 跃迁的生色团，当其电子跃迁偶极矩不平行时具有相互作用，产生激发态手征性图谱，可研究骨架及手性中心的立体化学。,55,CD解谱方法,三、圆二色谱解谱方法,经验规则：八区律、扇形规则、螺旋规则半经验方法：激发态手征性量化计算：ORD、ECD、VCD计算,56,CD解谱方法,基本原则之一：对映性规则（Antipodality）,57,对结构类似的一系列化合物，如果已知一个化合物的绝对构型，其类似物的绝对构型可通过比较CD确定。具有相同CE，表明它们的绝对构型相同；具有相反CE，表明它们的绝对构型相反。,CD解谱方法,58,基本原则之二：附近性规则（Vicinity）,CD解谱方法,对于生色团羰基，影响其CE符号的不对称因素的权重可依1 2 3 4考虑。距生色团较远的不对称碳原子基本不影响。因此，对生色团CE有影响的不对称碳原子的绝对构型可利用该生色团的CE特征来确定。,红点为不对称碳原子,59,CD解谱方法,1、八区律规则,八区律是通过饱和环酮中羰基生色团的CE，解析与其附近手性中心的绝对构型的经验规则。它建立在n*电子跃迁（290nm）理论研究的基础之上。,在平面上的原子对CE贡献为0，在前四区和后四区的原子对CE的贡献具有加合性。,60,CD解谱方法,61,CD解谱方法,62,CD解谱方法,(+)-3-methylcyclohexanone,24D = +13.5, UV: 0.0245mol/L in MeOH, max 282nm, 18.,63,(+)-3-Methylcyclohexanone的CD图谱,(+)-3-Methylcyclohexanone的ORD图谱,CD解谱方法,(+)-3-methylcyclohexanone is R.,64,CD解谱方法,注意如何将结构式放入八区空间，并如何观察各区的贡献。,胆甾酮-2,65,CD解谱方法,66,胆甾酮-3,CD解谱方法,饱和环戊酮的八区律及投影,67,CD解谱方法,羰基两侧的平伏卤素（或乙酰氧）取代基对CE影响较小，但可以使振幅A增加；直立卤素取代基则可以使CE红移，并使CE符号改变。,68,CD解谱方法,直立卤代酮规则,69,CD解谱方法,X-单晶衍射表明化合物（13）Br-为平展键，如构象A；但CD表明为（-）-CE，即溶液中为构象B。,-不饱和环己酮有两个Cotton效应带：,70,CD解谱方法,320-350nm (n*) Cotton效应可应用八区律解析图谱220-260nm (*) Cotton效应可应用螺旋规则解析图谱,-不饱和环己酮的八区律,71,-,当共轭双键与羰基在一个平面上，而其它环碳在平面外时，则环碳的位置决定CE的正负。,当双键与羰基不在一个平面上，双键的位置决定CE的正负。适用于六元和七元环的,-不饱和环酮。,注意：后四区符号与饱和环己酮的相反。,CD解谱方法,72,CD解谱方法,注意：后四区符号与饱和环己酮的相同，但与,-不饱和环己酮的相反。,-不饱和环戊酮的八区律,可应用于不饱和酮、二烯、螺（扭曲）烯、二硫化物等*跃迁生色团的CE判断。,73,CD解谱方法,2、螺旋规则,74,化合物1-methyl-19norprogesterones(VII)及其C-1异构体（VIII）,CD解谱方法,VII,VIII,对于,-不饱和环己酮，可观察320-350nm处CE的正负，判断环上突出平面的碳原子在环上方还是环下方。,75,CD解谱方法,化合物VII及其C-1异构体（VIII）的C=C-C=O生色团具有相反的手性（240-260nm)，应用螺旋规则可以确定它们的绝对构型。,76,CD解谱方法,内酯基团在210-220nm范围内有一弱的吸收带，为n*电子跃迁，其CE可用八区-扇形规则以及另一经验规则预测。,八区分布：,77,CD解谱方法,3、内酯的八区-扇形规则,78,扇形分布：,注意：从分子结构上面投影观察,CD解谱方法,注意：沿着O-C-O 角的平分线观察，按照八区律方式投影。,79,CD解谱方法,80,注意：从上面观察分子，投影到内酯的平面上。,CD解谱方法,或内酯中C-CO-O-C倾向于共平面成为一个稳定的构象，碳原子或处于该平面上或下，可用于CE的预测。碳原子在该内酯平面上呈现（+）-CE，在该内酯平面下呈现（-）-CE。,内酯的另一经验规则的应用,经验证明：决定n*电子跃迁产生的CE正负的主要是内酯环的手性，而不是或位的取代基的位置。,81,CD解谱方法,82,桥环内酯基团处于平面状态时，有两种构型。一