免疫功能分析

免疫功能分析,淋巴细胞成分及功能,T细胞活化动力学,流式细胞术多参数分析,多参数分析的最大的优势是能够在混合细胞群中对特定细胞亚群进行分析；如全血细胞的三色分析，CD3-PerCP选定CD3+细胞群，分析CD4+细胞CD69活化可以的表达；,淋巴细胞群的确定,淋巴细胞亚群的分布,T淋巴细胞的Th和Ts细胞亚群,NK细胞和B淋巴细胞亚群,Th和Ts细胞亚群早期活化细胞,Th和Ts细胞亚群中期活化细胞,Th和Ts细胞亚群辅助因子表达,CD28信号：仅仅TCR复合物与MHC复合物相互作用不能诱导T细胞活化，导致细胞长期低反应性、无能或细胞死亡；共刺激分子如CD28通过与APC细胞上的CD80/B7.1和CD86/B7.2相互作用，与TCR复合物共同诱导T细胞增殖、上调细胞因子及细胞因子受体的表达、上调涉及T细胞生存因子如Bcl-xL。,CD45RA是表达外显子B的CD45家族，CD45不同异型体存在于不同功能T细胞组份中，是既是重要的粘附分子又是T细胞重要的发育阶段标志，处女型或静止型T细胞表达CD45RA抗原,Fas/APO-1为跨膜蛋白，属于TNF超家族，介导细胞凋亡，CD95在 多数外周血CD4+T细胞和CD8+T淋巴细胞亚群表达，在活化的T细胞显著上调。,超级抗原活化T细胞的机制,超级抗原即来自各种病毒和细菌病原体的蛋白通过TCR-V与APC细胞的HLA II类分子相互作用刺激T细胞；与处理过的抗原识别TCR-V 和TCR-V链不同，超级抗原活化人类T细胞中表达TCR-V T细胞；链球菌内毒素(SEB)仅与TCR-V6反应而不与TCR-V8作用,细胞内细胞因子,细胞因子决定免疫效应细胞的构成和形成介导免疫功能的转化(保护性免疫和对病原体的炎症反应)任何异常调节形式将导致免疫病理状态：免疫缺陷或自身免疫在健康和疾病中起非常重要作用，是临床和基础研究的重点,在单个细胞水平分析细胞因子的表达；多参数分析确定细胞活化状态、细胞系及亚型、与其他细胞、组织结合能力；作用类型：autocrine, paracrine, or juxtacrine；混合细胞群中分析特定细胞类型,流式细胞术分析细胞内因子的优势,Th1/Th2细胞的检测及应用,新的Th1/Th2模型包括：一系列表达细胞因子的特定细胞群：T、B、NK和单核巨噬细胞系统；I型细胞涉及细胞介导的免疫反应，迟发过敏反应、巨噬细胞活化、下调II型反应，病毒、某些细菌刺激；II型细胞涉及体液免疫反应，B细胞增生、多克隆Ig分泌、下调I型反应，原虫、过敏原刺激。,细胞内细胞因子检测,Brefedlin A(BFA)在细胞被激活4小时内阻止细胞内合成蛋白质转运，使产生细胞因子滞留于细胞内荧光素结合的抗体标记细胞膜标记裂解红细胞、固定白细胞、细胞膜穿透、荧光素结合细胞因子抗体标记细胞，洗涤细胞流式细胞仪分析,T淋巴细胞内细胞因子的表达,IL-2是T细胞产生和分泌的细胞因子，诱导IL-2分泌是T细胞活化的第一步；IL-2又是活化T细胞的重要自分泌生长因子，是产生细胞毒T细胞所必需的；Th1型CD4+T细胞主要产生IL-2和INF-，Th2型CD4+T细胞则产生IL-4和IL-10,Th1和Th2细胞,病毒感染患者的外周血Th1/Th2 CD4+细胞亚群,PMA和Ionomycin刺激4小时Paraformaldehyde固定、Saponin膜穿透、GolgiStop阻断,此患者的CD4+T淋巴细胞以Th1为主,特定细胞亚群的功能状态与某些疾病过程关系,两例HIV阳性患者CD4+T细胞亚群对刺激反应存在差异#13患者CD4+和CD8+细胞对PMA刺激的反应强与#1患者#13患者在观察的5个月病情稳定#1患者则很快恶化死亡,细胞因子的产生是伴随细胞活化过程产生的，如图；多数情况下，未刺激的白细胞产生很少或难以检测到的细胞因子，必须以一定的方式体外活化刺激细胞因子的产生；,诱导细胞因子产生的条件,有多种活化因子能够诱导大量的细胞因子产生细胞，应用于流式细胞术分析；蛋白转运抑制剂能够增加细胞内细胞因子的蓄积，便于对细胞因子产生细胞的检测,不同蛋白转运抑制剂对细胞因子产生细胞检测的影响,应用PMA和Ionomycin刺激；GolgiPlug或GolgiStop阻断蛋白转运；TNF、IL-4抗体标记细胞内因子；GolgiPlug能够增强TNF的检测；GolgiStop增加IL-4的检测信号；两者均不增加自发荧光信号；,蛋白转运抑制剂的作用机制,GolgiPlug，monensin为一种离子载体，阻断离子跨膜梯度转移；Brefedlin A，是真菌代谢产物干扰从粗面内质网到Golgi复合物的管道转运,A GolgiPlug、B GolgiStopC 无蛋白转运阻止剂,FcR阻断,对于小鼠细胞需要用于FcR阻断剂(纯化的抗FcII/III受体抗体)减少非特异性荧光染色；对于人和兔细胞可以应用纯化同种的Ig或血清预先阻断Fc受体,细胞膜抗原标记：,细胞固定和膜通透,检测细胞内的细胞因子表达，细胞必须在穿透细胞膜前被固定，以维持细胞的结构完整性；细胞固定选用paraformaldehyde:含4%(w/v)paraformaldehyde的中性pH缓冲液(Dulbeccos PBS)细胞穿透选用去污剂saponin应用抗体标记的缓冲液含代谢抑制剂叠氮钠(0.09%w/v)，抑制抗体结合引起的细胞膜蛋白的再分布,细胞经过固定和膜通透后，荧光标记的进入细胞内，到达Golgi与细胞因子结合；目前已有多种形式的荧光标记的细胞因子抗体，包括FITC、PE、PerCP、APC等用于流式细胞术多参数分析,荧光素和抗体滴度,荧光素的选择：荧光强度FITCPEAPC依次增加；弱信号采用PE或APC，强信号采用FITC；由于荧光素结合抗体容易产生高水平的非特异背景信号，最好预先测定最佳抗体浓度，否则存在假阳性,对照的设置,细胞固定和膜穿透后，应用同一克隆的无荧光素结合抗体处理，能够区分细胞因子特异和非特异染色,应用重组细胞因子蛋白预处理阻断荧光标记抗体结合，区分特异荧光和非特异荧光标记；某些重组细胞因子反而增加非特异背景信号；,阴性对照和阳性细胞对照,荧光素结合的Isotype Ig作为阴性对照，阴性对照的抗体浓度应该与抗细胞因子抗体的浓度相同；细胞内细胞因子阳性对照细胞：检测操作过程和抗体的特异性；抗体浓度的确定,单核细胞细胞内细胞因子分析,LPS是单核细胞的特异刺激剂LPS刺激4小时全血选定CD14-的淋巴细胞群和CD14+的单核细胞群只有CD14+单核细胞群表达细胞因子TNF-,完整细胞和膜通透细胞对细胞膜抗体标记的影响,全血和外周血单个核细胞比较,单核细胞产生细胞因子图谱,上图：IL-1 FITC/IL-1a PE/CD14 PerCP/ TNF APC；中图： IL-1 FITC/ IL-1 PE/CD14 PerCP /TNF APC；下图： IL-8 FITC/IL-6 PE/CD14 PerCP /TNF APC；,外周血树突状细胞,树突状细胞(dendritic cell, DC)是抗原摄取、处理和递呈给T淋巴细胞的专职抗原递呈细胞。缺乏淋巴细胞、单核细胞、粒细胞的系特异性标记(Lin-)；表达CD83和CMRF-44细胞膜标志；CD123、CD11c或HLA-DR,DC定义为R3区、R4区及R5区,外周血DC局限于R7=R1 and R2 (R3 or R4 or R5)；红色为CD123+DC、绿色为CD11c+DC