副猪嗜血杆菌的病原学检测

副猪嗜血杆菌的病原学检测RESEARCH ON DETECTION OF HAEMOPHILUS PARASUIS,汇报内容,研究背景 研究的主要内容 结果与分析 小结,研究背景,随着我国规模化养猪业的发展，副猪嗜血杆菌感染有明显增加趋势，已成为猪场保育仔猪发病率和死亡率增加的重要原因之一，造成重大经济损失。由于需要从病原学角度证实，而我国缺乏用于副猪嗜血杆菌检测的标准血清及诊断方法，因此我们开展相关研究。,解决方法,1 分离鉴定副猪嗜血杆菌。进行副猪嗜血杆菌的流行病学调查，从而生产相对于主要流行优势菌株的疫苗。建立副猪嗜血杆菌的快速诊断方法，为控制该病提供前提。,研究的主要内容,1病原的分离鉴定。2标准血清、分型方法的建立和临床应用。3转铁结合蛋白PCR诊断方法的建立和临床应用。,第一章 副猪嗜血杆菌的分离鉴定,病料采集剖检样品的病变表现为胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。我们采集病变的肺脏和扁桃体作为病原分离的样本。病原菌分离方法 在无菌操作条件下从疑似病猪的肺脏和扁桃体等病料中取样, 在巧克力琼脂平板或TSA培养基上划线接种, 37 培养48 h后挑取单个菌落,转接相同的培养基再进行纯培养。涂片镜检 挑取上述纯培养菌落涂片,革兰氏染色后观察细菌形态。,分离鉴定两株副猪嗜血杆菌,分离菌株溶血性测定,16s rRNA PCR鉴定,两株副猪嗜血的血清型鉴定,用本实验室制备的Hps标准阳性血清对本地分离菌株进行血清型鉴定。(1) 琼脂扩散方法：湖北分离株血清型为5型，湖南分离株则未能检测出血清型。(2) 间接血凝抑制方法: 检测出湖北分离株的血清型为5型，湖南分离株的血清型为13型。,分析与讨论,对于Hps 分离较为困难, 需要在典型新鲜病料的采集、适宜的培养条件及分离者的判断经验上更为关注, 才能提高其临床分离率。这两株副猪嗜血杆菌分离株对麦芽糖、葡萄糖、蜜三糖、木糖、阿拉伯糖、D-核糖、接触酶、氧化酶、甘露醇、山梨糖、乳糖、尿素酶反应表现为一致,但对蔗糖、半乳糖、果糖、和H2S、山梨醇、甘露糖的生化反应不一致。,第二章 副猪嗜血杆菌的血清学分型方 法的建立和临床应用,标准抗原制备,制备,分离株分型,标准阳性血清,家兔免疫,分型方法的建立,检测抗原的制备,盐析抗原(Salt Antigen)含菌量为1.8109 CFU/mL 煮沸抗原(Boiled Antigen)含菌量为3109 CFU/mL热稳定抗原（Heat-stable Antigen）含菌量为1.8109/mL,结果分析,免疫后抗体产生的规律(Hps-5、Hps-1为例),抗血清效价检测,抗血清的在两种检测方法中的特异性,抗血清的保存期测定,将所保存的不同时期的Hps-5抗血清用于玻片凝集试验。,分离株的鉴定,将保存的96株副猪嗜血杆菌制作成相应的热稳定分型抗原，利用本试验制备标准阳性血清，采用琼脂扩散试验进行分型。,分析与讨论,标准副猪嗜血杆菌在家兔内产生抗体的强弱。 本研究中探索了琼脂扩散方法和玻片凝集方法在副猪嗜血杆菌血清分型中的应用。三种分型抗原在琼脂扩散分型方法的应用。,第三章 副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白 PCR诊断方法的建立和临床应用,副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白tbpB保守序列的筛选标准副猪嗜血杆菌（15个血清型）tbpB的检测该方法灵敏性、特异性检测人工感染病料和临床病料的检测讨论分析,副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白tbpB保守序列的选用,将tpbB-PCR检测的目的片段在NCBI网站上经过BLAST比对后发现，该基因5端225bp到514bp（288个nt）片段在大部分Hps中保守,不同血清型副猪嗜血杆菌tbpB的检测,对15种血清型的标准Hps进行扩增，由结果可知1、3、4、 5、6、7、8 、11 、12、13、15型菌株均能通过本实验检测，而9、10、14型菌株未被检测出此目的带。,灵敏性试验,将Hps-5型标准菌株的培养后，用比浊管测定，菌液浓度为1.25109 CFU/mL，模板稀释倍数依次为100、101、102、103、104、105、106、107、108、109后进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示。可见阳性结果的最高稀释度为稀释105倍，后取2L 做为模板，因此推算出PCR反应中最低检测量为25 CFU/mL。,特异性试验,仅有Hps(lane1,3)扩增出目的带，而多杀性巴氏杆菌（lane 4） ，大肠杆菌（lane 5）,沙门氏菌（lane 6）为PCR阴性，如图6。该方法在检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌标准菌株过程中，仅在血清型9型中扩增出微弱目的带，其余为阴性，如图7。,人工感染病样的检测,选择猪副猪嗜血杆菌抗体阴性30日龄的猪，攻毒后收集猪死亡后的肺和脑，置-20保存备用, 作为阳性材料；对照猪在3d后扑杀，采集肺和脑，置-20保存备用，作为阴性材料。图8为从组织病料中直接提取该菌基因的结果。图9为病料中细菌过夜培养后提取的基因组的检测结果。,临床病料中检测的结果,对送检的18份临床病料进行tpbB-PCR检测7、 14号样品中出现288bp的目的带。,临床病料的16S rRNA-PCR检测结果,在相应的16S rRNA检测过程中，7、14号样品中出现821bp的目的带,分析与讨论,为了评估tbpB-PCR方法的特异性，12种血清型的APP和多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌一些其他的菌株被用于实验，结果11个血清型的APP和一些其它菌株的检测结果均为阴性，这有力证明了我们所确定的tbpB的序列在Hps中的保守性。 实验比较了2种不同的模板制作方法，一种是碾磨病料，直接提取病菌的全基因组作为模板。第二种是将小块病料在TSB液体中过夜培养，煮菌，离心后提取上清作为模版。结果显示第二种方法制做模板所检测的效果明显优于第一种方法。因此我们认为该方法灵敏性较高，模板制作方法简单，更加适用于临床病料的检测。根据文献介绍，Hps多定居在鼻腔和扁桃体，所以我们在采集病料过程中也应该注意这一点，这也会影响到我们检测该菌的敏感度。,小 结,从病料中分离鉴定了2株副猪嗜血杆菌。制备了15个血清型的副猪嗜血杆菌标准阳性血清及对96株Hps进行了血清型分型。 对不同血清型tbpB基因进行了调查并建立了副猪嗜血杆菌tbpB-PCR检测方法，为本病的诊断提供了有力工具。,相关研究文章,1 王磊，何启盖，蔡旭旺，陈焕春，刘正飞，P.J. Blackall副猪嗜血杆菌标准抗血清的制备及临床应用中国兽医杂志（在投）2. Cai X, Chen H, Blackall PJ, Yin Z, Wang L, Liu Z, Jin M. Serological characterization of Haemophilus parasuis isolates from China. Veterinary Microbiology, 2005,111( 3-4): 231-236,致 谢,感谢指导老师何启盖教授对我课题的指导！感谢实验室全体同学对我的支持与帮助！本研究是在湖北省自然科学基金创新团体项目(2001ABA19)资助完成的。,感谢评审老师对我论文的评阅！请各位老师多提宝贵意见！谢谢大家！,Hps标准阳性血清的制备,免疫原的制备每种血清型标准菌株分别免疫3只家兔。免疫程序首次免疫用0.5毫升（含菌量为109CFU）与等量的福氏不完全佐剂充分混合，在颈背部皮下分四点注射兔子。两个星期后,将菌液浓度增至