免疫学检测上课

免疫学的临床应用,免疫检测免疫治疗免疫预防,提要,利用免疫学原理建立的免疫学检测技术主要应用于对多种免疫性疾病（感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应和肿瘤等）的诊断、疗效评估、发病机制探讨、以及对抗原性物质或免疫细胞的定性、定量，对细胞因子、粘附分子及细胞受体的检测等。,免疫学检测,一、抗原或抗体的检测,二、淋巴细胞的测定,三、免疫学检测方法的应用,免疫学诊断,（一）抗原抗体反应的原理,免疫学诊断,一、抗原或抗体的检测,1、抗原抗体反应的 特异性（1）特异性：基于两 种分子间的结构互补性和亲和性。（2）可逆性（3）适宜的条件：电解质、pH、温度等,2、抗原抗体反应的可见性 抗原抗体按适当比例结合，形成肉眼可见的现象。,应 用,1、利用已知抗原检测未知抗体,（1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病： 伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。（2）检测自身抗体诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等,2、利用已知抗体检测未知抗原,（1）鉴定病原菌：诊断疾病（2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌（3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定（4）检测药物半抗原： 确认运动员是否服用兴奋剂,（二） 抗原或抗体的检测类型,凝集反应沉淀反应免疫标记技术,（一）凝集反应（agglutination）,颗粒性抗原（红细胞、细菌、 乳胶颗粒等）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。,（1）、直接凝集反应： 将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。（2）、间接凝集反应： 将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。,乳胶颗粒,红细胞,类风湿因子检测妊娠试验,间接凝集,直接凝集,、直接凝集反应：玻片法：已知AbAg（血型，细菌鉴定）举例 试管法：已知AgAb（血清抗体效价）、间接凝集反应：可溶性抗原载体颗粒致敏颗粒凝集,玻片法举例,已知抗痢疾杆菌的抗体（1）已知抗伤寒杆菌的抗体（2）未知某细菌未知细菌+（1） 未出现凝集块未知细菌+（2）出现凝集块结论：该细菌是什么细菌？,（二）沉淀反应（precipitation）,可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合， 形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。可分为单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫电泳、免疫比浊法等。,(1)、单向免疫扩散,是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比相关。本法常用于测定血清IgG、IgM、IgA 和 C 3等的含量。,含抗体的凝胶,沉淀环,（2）、双向免疫扩散,是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性 、组成和两种抗原相关性分析的检测。,3、免疫标记技术,用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。,（1）、免疫荧光显微技术,是用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，FITC) 与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。 包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。,（2）、酶免疫测定(Enzyme Immunoassay, EIA),是用酶（常用的有辣根过氧化物酶，HRP和碱性磷酸酶，AP) 标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体， 后者测定组织中或细胞表面的抗原。,酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA),是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法BAS-ELISA等。,（1）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay)原理：将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面酶标记抗体或抗抗体+抗原+底物显色深浅反映标本中抗原或抗体,ELISA 检测抗体,双抗夹心法,DAB,（3）、放射免疫测定法(Radioimmunoassay, RIA),是用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达pg水平。常用于标记的放射性核素有I125和I131。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。,二、 淋巴细胞 的测定,检测各群体淋巴细胞的数量与功能是观察机体免疫状态的重要手段。,（一）、免疫细胞数量检测,1、T细胞数量检测（1）、花结试验：E花结试验可用于检测T细胞数目。70%-80%2、B细胞数量检测（2）、EA花结试验可用于检测B细胞数目。8%-15%,花结试验示意图,（二）、免疫细胞功能检测1、T细胞功能测定,体外法 ：T细胞增殖试验 形态学检查 3H-TdR掺入法 MTT法体内法 ： 用生物抗原或化学抗原作皮内试验。 OT-PPD皮试 SD-SK皮试,淋巴细胞转化试验（形态学示意图）,原理：人T细胞表面有PHA或ConA受体，T细胞在体外受PHA或ConA的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定T细胞的功能。,（二）淋巴细胞功能测定,T细胞功能测定,T细胞增殖试验（淋转）：丝裂原、抗CD3单克隆抗体等能非特异地激活T细胞，使之发生转化增殖，计算淋巴母细胞转化率（正常值6580%） 。,第二节 免疫学防治,提 要 免疫预防有人工主动免疫和人工被动免疫。人工自动免疫是人为地给机体注射含有具有抗原性的物质（疫苗），使机体主动产生特异性免疫力；人工被动免疫是直接给机体注射抗原特异性抗体等，使机体被动获得特异性抵抗力。,菌苗、疫苗（用细菌等微生物制成的制品）,分死、活疫苗,死疫苗微生物毒力较强已被杀死易保存，较稳定接种剂量大，2-3次免疫效果较低，持续1年左右可多种混合使用,活疫苗微生物无毒或毒力低活的不易保存剂量小，1次较高，持续15年多单纯使用,脊髓灰质炎糖丸,一、人工主动免疫 1、 死疫苗（灭活疫苗）是选用免疫原性强的病原体，经理化方法使其失去活力制备而成的疫苗。伤寒菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌、钩端螺旋体、流感病毒、狂犬病病毒、乙脑病毒疫苗均为灭活疫苗。 2、 减毒活疫苗：是用减毒或无毒力的活病原体制成的疫苗。脊髓灰质病毒、卡介苗、麻疹病毒疫苗是常用的减毒活疫苗。 3、 类 毒 素：细菌外毒素经甲醛处理后，失去毒性而保留其免疫原性即为类毒素。常用的类毒素有破伤风类毒素、白喉类毒素等。,死疫苗和活疫苗的比较,二、人工被动免疫 是给人体注射含特异性抗体的免疫血清或细胞因子等制剂，以治疗或紧急预防感染疾病。人工被动免疫力维持的时间短，约23周。常用制剂有： 抗毒素 人免疫球蛋白制剂 细胞因子制剂 单抗/基因工程抗体,比较,死疫苗与活疫苗,人工主动免疫与人工被动免疫,比较,免疫治疗(immunotherapy),针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能 以达到治疗疾病的治疗方法称之。,免疫调节（immunomodulation） 利用物理、化学和生物学的手段来调节机体的免疫功能，使原有的免疫功能增强或减弱。免疫重建(immunoreconstitution) 将免疫功能正常个体的造血干细胞或淋巴细胞移植给患有免疫功能缺陷的个体，使后者的免疫功能全部或部分得到恢复。,针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制 机体的免疫功能以达到治疗疾病的治疗方法。、免疫增强疗法主要用于治疗感染、肿瘤、免疫缺陷等免疫功能低下的疾病。、免疫抑制疗法主要用于治疗超敏反应、自身免疫性疾病、移植排斥、炎症等。,（一）免疫增强剂,化学制剂：1、左旋咪唑 2、西咪替丁,微生物制剂：1、卡介苗（BCG） 2、短小棒状杆菌 3、微生物提取物,中药制剂： 黄芪、人参、 枸杞子等,免疫增强剂与免疫抑制剂,免疫因子：1、转移因子 2、免疫核糖核酸 3、胸腺肽,适应症：免疫功能低下的患者 （1）恶性肿瘤 （2）免疫缺陷病 （3）传染病,副作用：较轻,二、 免疫抑制剂,化学制剂1、烷化剂：环磷酰胺2、抗代谢药：激素：糖皮质激素真菌代谢产物1、 环孢素A：对T，尤其是TH有较好的选择性抑制作用2、FK-506：其作用强于环孢素A10-100倍，且与环孢素A有明显的协同作用。 中药及其有效成分雷公藤多甙,免疫抑制药物的适应症和副作用,适应症：免疫功能过高引起机体损害的患者 1、抗移植排斥 2、超敏反应性疾病：激素 3、自身免疫病：激素、雷公藤多甙 4、感染性炎症：激素,副作用：明显 ，主要是骨髓抑制、肝肾毒性等 其抑制作用是非特异性的，长期应用可导致：继 发性免疫缺陷 、 严重感染、 肿瘤,免疫重建,定义：将免疫功能正常个体的造血干细胞或淋巴干细胞，移植给免疫缺陷个体，使后 者的造血能力、免疫功能全部或部分得 到恢复。方法：骨髓移植、脐血干细胞移植作用：治疗免疫缺陷病、白血病、,三、过继免疫,给患者转输能继续扩增的效应细胞的一种治疗方法。如：骨髓移植、LAK细胞法。,四、计划免疫,根据某些特定传染病的疫情监测和人群免疫状态分析，按照规定的程序有计划地进行人群预防接种，以提高人群免疫水平，达到控制以至消灭相应的传染病的重要措施。,用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性,荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明（红色荧光）,放射性同位素： 125I、131I,酶：辣根过氧化物酶、硷性磷酸酶,免疫荧光检测法（IFA）,放射免疫检测法（RIA）,酶免疫检测法（EIA）,（四）免疫标记技术,液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）,直接荧光法,间接荧光法,免疫荧光技术,间接法双抗夹心法竞争法E: 辣根过氧化酶 HRPS: 底物 二氨基联苯胺 DAB/邻苯胺,酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA法）,间接法,DAB,双抗夹心法,DAB,BAS-ELISA法（ biotin-avidin-system，生物素-抗生物素系统-ELISA法）：敏感性更高。用于抗原抗体以及DNA、RNA的检测。,卵白及某些微生物中的蛋白质,灵敏度达pg水平。常用于微量物质测定，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、地高辛等药物以及IgE等。,放射免疫检测法（RIA）,竞争法,能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测多种病毒的抗体或抗原，如抗HIV抗体的检测。,免疫印迹法,二、淋巴细胞的测定,（一）淋巴细胞的分离与类型鉴定,1、淋巴细胞的分离：外周血葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法,白膜层,单核细胞,淋巴细胞,B,T,吸附分离,过尼龙毛柱分离,（1）间接免疫荧光法：鉴定细胞的群、亚群。,用CD3、CD4、CD8单克隆抗体检测患者外周血T细胞表面相应抗原CD3+ T细胞，计算T细胞总数。 CD4+ CD4+T细胞，计算CD4+T细胞数。 CD8+CD8+ T细胞，计算 CD8+亚群T细胞数 计算CD4+ / CD8+比例,正常人PMB中T细胞占6575% CD4+ / CD8+约为1.52,2、淋巴细胞的类型鉴定：淋巴细胞表面标记检测、 记数,用mIgM、mIgD单克隆抗体检测患者外周血B细胞表面相应的抗原已检测B细胞的数量,正常人外周血中SmIg+ 细胞占812%,（2）流式细胞术（flow cytometry）,（二）淋巴细胞功能测定,1、T细胞功能测定,（1）T细胞增殖试验（淋转）：丝裂原、抗CD3单克隆抗体 等能非特异地激活T细胞，使之发生转化增殖，计算淋巴母细胞转化率（正常值6580%） 。 形态学观察法 3H-TdR渗入法：用液体闪烁仪测定样品的射线放射活性 MTT法,（2）淋巴细胞介导的细胞毒试验（LMC） 检测CTL、NK、 LAK、TIL细胞杀伤靶细胞的功能,（2）抗体形成细胞测定 溶血空斑试验 （hemolytic forming cell assay，HFC）计算HFU/ml,2、B细胞功能测定,（1）B细胞增殖试验：LPS、SPA刺激，检查抗体形成细胞 的数目,可用于鉴定分离的淋巴细胞亚群，监测某些疾病状态的细胞免疫功能。IL-2、IL-2R、rIFN 、TNF等检测。免疫学方法：ELISA、RIA等。 细胞生物学方法 分子生物学方法，如聚合酶链反应（PCR）法等,3、细胞因子检测,4、体内免疫细胞功能测定：皮肤试验,（1）迟发型超敏反应：旧结核菌素试验（ OT试验 ） 皮试（+）有一定的细胞免疫能力 皮试（）细胞免疫功能缺损,（2）速发型超敏反应：青霉素皮试、 异种血清皮试,分类,一、免疫增强疗法和免疫抑制疗法,三、主动免疫治疗（active immunotherapy）和被动免疫治疗（passive immunotherapy）,二、特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗,（一）免疫增强剂,化学制剂：1、左旋咪唑 2、西咪替丁,微生物制剂：1、卡介苗（BCG） 2、短小棒状杆菌 3、微生物提取物,中药制剂： 黄芪、人参、 枸杞子等,免疫增强剂与免疫抑制剂,免疫因子：1、转移因子 2、免疫核糖核酸 3、胸腺肽,适应症：免疫功能低下的患者 （1）恶性肿瘤 （2）免疫缺陷病 （3）传染病,副作用：较轻,二、 免疫抑制剂,化学制剂1、烷化剂：环磷酰胺2、抗代谢药：激素：糖皮质激素真菌代谢产物1、 环孢素A：对T，尤其是TH有较好的选择性抑制作用2、FK-506：其作用强于环孢素A10-100倍，且与环孢素A有明显的协同作用。 中药及其有效成分雷公藤多甙,免疫抑制药物的适应症和副作用,适应症：免疫功能过高引起机体损害的患者 1、抗移植排斥 2、超敏反应性疾病：激素 3、自身免疫病：激素、雷公藤多甙 4、感染性炎症：激素,副作用：明显 ，主要是骨髓抑制、肝肾毒性等 其抑制作用是非特异性的，长期应用可导致：继 发性免疫缺陷 、 严重感染、 肿瘤,抗体为基础的免疫治疗,一、免疫血清抗毒素血清、胎盘（丙种）球蛋白、抗菌免疫血清、抗病毒免疫血清、抗淋巴细胞丙种球蛋白等,二、单克隆抗体（mAb）：用于靶向治疗等。,三、基因工程抗体：降低抗体的免疫原性嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双价抗体、双特异性抗体等,抗原为基础的免疫治疗,细胞因子及其拮抗剂为基础的免疫治疗,LAK（lymphoki