《生长繁殖及控制》PPT课件.ppt

第七章微生物的生长繁殖及其控制 本章主要内容 微生物生长研究方法 微生物如何进行生长 影响微生物生长的因素是什么 如何控制微生物的生长 生物个体物质有规律地 不可逆增加 导致个体体积扩大的生物学过程 生长 生物个体生长到一定阶段 通过特定方式产生新的生命个体 即引起生命个体数量增加的生物学过程 繁殖 生长是一个逐步发生的量变过程 繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程 在高等生物里这两个过程可以明显分开 但在低等特别是在单细胞的生物里 由于细胞小 这两个过程是紧密联系又很难划分的过程 一个微生物细胞 合适的外界条件 吸收营养物质 进行代谢 如果同化作用的速度超过了异化作用 个体的生长原生质的总量 重量 体积 大小 不断增加 如果各细胞组分是按恰当的比例增长时 则达到一定程度后就会发生繁殖 引起个体数目增加 群体内各个个体的进一步生长 群体的生长 群体生长 个体生长 个体繁殖 个体生长 个体繁殖 群体生长 在一定时间和条件下细胞数量的增加 微生物群体生长 微生物生长 在微生物学中提到的 生长 一般均指群体生长 这一点与研究大生物时有所不同 一 微生物纯培养方法 纯培养 pureculture 微生物学中把从一个细胞经过培养繁殖而得到的后代 称纯培养 第一节微生物生长的研究方法 平板涂布分离法 SpreadPlate 简单易行 但易造成机械损伤 平板划线分离法 StreakPlate 特点 快速 方便 分区划线 适用于浓度较大的样品 连续划线 适用于浓度较小的样品 稀释倒平板法 PourPlate 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 9ml 9ml 9ml 9ml 首先将待分离的样品进行连续稀释 目的是得到高度稀释的效果 使一支试管中分配不到一个微生物 这种方法适合于细胞较大的微生物 液体稀释法 选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物 可以根据该微生物的特点 包括营养 生理 生长条件等 采用选择培养的方法进行分离 利用选择培养基进行直接分离富集培养 单细胞 单孢子 分离法 毛细管法 用毛细管提取微生物个体 适合于较大微生物 显微操作仪 用显微针 钩 环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养 小液滴法 将经过适当稀释后的样品制成小液滴 在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离 二 微生物的培养方法 通常情况下 微生物的培养方法根据培养过程中对氧的需要与否分为好氧培养和厌氧培养 根据所用培养基的物理特性分为固体培养和液体培养 一 好氧培养方法1 固体培养方法2 液体培养方法 二 厌氧培养方法实验室中常用厌氧手套箱 Hungate滚管及厌氧罐 通常用来测定细菌 酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数量 细菌 孢子 酵母菌 三 生长繁殖测定方法 一 计数法 1 显微镜直接计数法 1 常规方法 采用细菌计数板或血球计数板 在显微镜下对微生物数量进行直接计数 计算一定容积里样品中微生物的数量 缺点 不能区分死菌与活菌 不适于对运动细菌的计数 需要相对高的细菌浓度 个体小的细菌在显微镜下难以观察 2 其它方法 将已知颗粒浓度的样品 例如血液 与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度 比例计数 2 涂布平板计数法 采用培养平板计数法要求操作熟练 准确 否则难以得到正确的结果 样品充分混匀 每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液 同一稀释度三个以上重复 取平均值 每个平板上的菌落数目合适 便于准确计数 一个菌落可能是多个细胞一起形成 所以在科研中一般用菌落形成单位 colonyformingunits CFU 来表示 而不是直接表示为细胞数 3 倒平板计数法 PourPlate 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 9ml 9ml 9ml 9ml 4 膜过滤培养法 当样品中菌数很低时 可以将一定体积的湖水 海水或饮用水等样品通过膜过滤器 然后将将膜转到相应的培养基上进行培养 对形成的菌落进行统计 二 生物量法 1 比浊法 在一定波长下 测定菌悬液的光密度 以光密度 opticaldensity 即O D 表示菌量 实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内 否则不准确 2 重量法 干重法 将微生物菌体或离心得到的细胞沉淀物置100 105 的烘箱中干燥至水份去除 然后再称重 湿重法 收集微生物菌体 或将微生物培养液离心 收集细胞沉淀物 然后称重 通过样品中蛋白质 核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量 测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法 三 生理指标法 微生物的生理指标 如呼吸强度 耗氧量 酶活性 生物热等与其群体的规模成正相关 样品中微生物数量多或生长旺盛 这些指标愈明显 因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪 微量量热计等设备来测定相应的指标 常用于对微生物的快速鉴定与检测 四 同步培养 同步培养 Synchronousculture 使群体中的细胞处于比较一致的 生长发育均处于同一阶段上 即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法 同步生长 通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物 获得同步生长的方法 获得同步生长的方法主要有两类 1 选择法 选择性过滤 梯度离心 膜洗脱法 2 诱导法 变换温度 光线 培养基等 造成与正常细胞周期不同的周期变化 五 连续培养 将微生物置于一定容积的培养基中 经过培养生长 最后一次收获 分批培养 batchculture 或封闭培养 closedculture 培养基一次加入 不予补充 不再更换 连续培养 Continousculture 在微生物的整个培养期间 通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法 控制连续培养的方法 不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定 恒浊连续培养 保持恒定的流速 培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则 恒化连续培养 一 恒浊连续培养 恒浊器 测定所培养微生物的光密度值 自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速 使培养物维持在某一恒定浊度 如果所用培养基中有过量的必需营养物 就可以使菌体维持最高的生长速率 一 恒浊连续培养 一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业 连续发酵 连续发酵与单批发酵相比的优点 缩短发酵周期 提高设备利用率 便于自动控制 降低动力消耗及体力劳动强度 产品质量较稳定 缺点 杂菌污染和菌种退化 二 恒化连续培养 恒化器 使培养液流速保持不变 并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖 二 恒化连续培养 恒化连续培养中 必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度 以作为限制性因子 而其他营养物均过量 细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度 并低于最高生长速率 限制性因子必须是机体生长所必需的营养物质 如氨基酸和氨等氮源 或是葡萄糖 麦芽糖等碳源或者是无机盐 通过控制流速可以得到生长速率不同但密度基本恒定的培养物 多用于科研 遗传学 突变株分离 生理学 不同条件下的代谢变化 生态学 模拟自然营养条件建立实验模型 恒浊器与恒化器的比较 第二节微生物的生长微生物的生长表现在微生物的个体生长与群体生长两个水平上 微生物个体生长表现为个体质量和体积的增加 微生物群体生长是以微生物细胞的数量或微生物群体细胞物质量的增加作为生长的指标 一 细菌的个体生长 1 DNA的复制和分离双向方式连续复制 复制区 2 细胞壁扩增杆菌中是新合成的肽聚糖在新旧Cw均有分布 而球菌是在赤道板插入 固定位置 一 无分支单细胞微生物的群体生长 二 微生物的群体生长 细胞呈指数增长 特征 每经历一个代时 细胞的数目就增加1倍 呈指数增加 因而被称为指数生长 这就是无分支单细胞微生物的群体生长特征 1 无分支单细胞微生物群体生长的特征 细胞数目的对数与生长时间呈正比直线关系 2 生长曲线 GrowthCurve 细菌接种到定量的液体培养基中 定时取样测定细胞数量 以培养时间为横座标 以菌数为纵座标作图 得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线 一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期 对数期 稳定期和衰亡期等四个生长时期 迟缓期 Lagphase 将少量菌种接入新鲜培养基后 在开始一段时间内菌数不立即增加 或增加很少 生长速度接近于零 也称延迟期 适应期 迟缓期的特点 分裂迟缓 代谢活跃 细胞形态变大或增长细胞内RNA 尤其是rRNA含量增高 合成代谢活跃 核糖体 酶类和ATP的合成加快 易产生诱导酶 对外界不良条件反应敏感 细胞处于活跃生长中 只是分裂迟缓 在此阶段后期 少数细胞开始分裂 曲线略有上升 迟缓期出现的原因 微生物接种到一个新的环境 暂时缺乏分解和催化有关底物的酶 或是缺乏充足的中间代谢产物等 为产生诱导酶或合成中间代谢产物 就需要一段适应期 调整代谢 迟缓期的长短与菌种的遗传性 菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关 短的只需要几分钟 长的需数小时 在生产实践中的常用以下手段缩短迟缓期 1 通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短 2 利用对数生长期的细胞作为种子 3 尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大 4 适当扩大接种量 对数生长期 Logphase 又称指数生长期 Exponentialphase 以最大的速率生长和分裂 细菌数量呈对数增加 细菌内各成分按比例有规律地增加 表现为平衡生长 应用意义 增殖噬菌体的最适菌龄 生产上用作接种的最佳菌龄 发酵工业上尽量延长该期 以达到较高的菌体密度 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 是生理代谢及遗传研究或进行染色 形态观察等的良好材料 由于营养物质消耗 代谢产物积累和pH等环境变化 逐步不适宜于细菌生长 导致生长速率降低直至零 稳定生长期 Stationaryphase 细胞重要的分化调节阶段储存糖原等细胞质内含物 芽孢杆菌在此阶段形成芽孢或建立自然感受态等 也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段 某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期 生产上常通过补充营养物质 补料 或取走代谢产物 调节pH 调节温度 对好氧菌增加通气 搅拌或振荡等措施延长稳定生长期 以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物 衰亡期 Decline或Deathphase 营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累 细菌死亡速率超过新生速率 整个群体呈现出负增长 细菌代谢活性降低 细菌衰老并出现自溶 产生或释放出一些产物 如氨基酸 转化酶 外肽酶或抗生素等 细胞呈现多种形态 有时产生畸形 细胞大小悬殊 有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等 第七章微生物的生长繁殖及其控制 第一节微生物生长的研究方法 第二节微生物的生长 一 细菌的个体生长 二 微生物的群体生长 二 丝状微生物的群体生长 丝状微生物的纯培养采用孢子接种 在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养 菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构 可以用菌丝干重作为衡量生长的指标 即以时间为横坐标 以菌丝干重为纵坐标 绘制生长曲线 可分为三个阶段 1 生长停滞期 2 迅速生长期 3 衰退期 菌丝体干重下降 到一定时期不再变化 三 生长的数学模型 对数生长期中微生物的生长可用数学模型表示 由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代 一个世代所需的时间就是代时 enerationtime G 群体细胞数目扩大一倍所需时间 称为倍增时间 指数生长可以用下式表示 Nt No 2nNt No和t可由试验获得 n可通过上式计算得出 将等式两侧取对数重排后得 lgNt lgNo nlg2lgNt lgNo lgNt lgNolg20 301 式中 No为起始细胞数目 Nt为指数生长某个时刻t时的细胞数目 n为世代数 n 例如 一培养液中微生物数目由开始的12 000 No 经4h t 后增加到49 000 000 Nt 这样 n lg4 9 107 lg1 2 104 0 301 12 借助于n和t 还可以计算出不同培养条件下的代时G G t n在本例中 G 4 60 12 20min 该种微生物的代时为20分钟 在4小时内共繁殖了12代 第三节环境因素对微生物生长的影响 影响微生物生长的外界因素很多 主要因素有温度 氧气 pH值以及营养物质等 温度对微生物的影响具体表现在 影响酶活性影响细胞膜的流动性 影响物质的溶解度 一 温度对微生物生长的影响 微生物生长的温度范围 10 100度每种微生物都有自己的生长温度三基点 即最低 最适 最高生长温度 处于最适生长温度时超过最低生长温度时超过最高生长温度时 一 微生物生长的三个温度基点 二 微生物生长温度类型 低温型微生物 嗜冷微生物 中温型微生物 嗜温微生物 高温型微生物 嗜热微生物 1 嗜冷微生物 最适生长温度在5 20 主要分布 地球的两极 冷泉 深海 冷冻场所及冷藏食品中 嗜冷微生物在低温下生长的机理 据推测有两种原因 它们体内的酶能在低温下有效地催化 在高温下酶活丧失 细胞膜中的不饱和脂肪酸含量高 低温下也能保持半流动状态 可以进行物质的传递 2 嗜温微生物 最适生长温度为20 45 大多数微生物属于此类 室温型主要为腐生或植物寄生 在植物或土壤中 体温型主要为寄生 在人和动物体内 3 嗜热微生物 最适生长温度为55 65 主要分布 在高温下能生长的原因 酶蛋白以及核糖体有较强的抗热性 核酸具有较高的热稳定性 细胞膜中饱和脂肪酸含量高 较高温度下能维持正常的液晶状态 高温微生物的特点 生长速度快 合成大分子迅速 可及时修复高温对其造成的分子损伤 耐高温菌具应用优势 在减少能源消耗 减少染菌 缩短发酵周期等方面具重要意义 根据微生物与氧的关系 可把它们分为几种类群 好氧菌微好氧菌兼性好 厌 氧菌耐氧菌厌氧菌 二 氧气对微生物生长的影响 1 专性好氧菌 strictaerobe 必须在有分子氧的条件下才能生长 有完整的呼吸链 以分子氧作为最终氢受体 细胞含有超氧物歧化酶 SOD superoxidedismutase 和过氧化氢酶 2 微好氧菌 microaerophilicbacteria 只能较低的氧分压下才能正常生长 通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能 3 兼性好 厌 氧菌 facultativeaerobe 在有氧或无氧条件下均能生长 但有氧情况下生长得更好 在有氧时靠呼吸产能 无氧时接发酵或无氧呼吸产能 细胞含有SOD和过氧化氢酶 4 耐氧菌 aerotolerantanaerobe 可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌 生活不需要氧 分子氧也对它无毒害 不具有呼吸链 依靠专性发酵获得能量 细胞内存在SOD和过氧化物酶 但缺乏过氧化氢酶 5 厌氧菌 anaerobe 细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶 大多数还缺乏过氧化氢酶 在氧还原为水的过程中 可形成某些有毒的中间产物 例如 过氧化氢 H2O2 超氧阴离子 O2 等 好氧微生物具有降解这些产物的酶 如过氧化氢酶 过氧化物酶 超氧化物歧化酶等 而严格厌氧菌缺乏SOD 故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死 厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说 H2O O22O2 2H O2 H2O22H2O O2 eO2 O2 超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成 超氧物阴离子歧化酶是在生物进化中发展出来的一种自我保护方式 生物体中超氧阴离子的形成与去除 12 SOD好氧生物和耐氧细菌 过氧化氢酶好氧生物 过氧化物酶NADH2NAD耐氧菌 原因 1 影响膜表面电荷的性质及膜的通透性 进而影响对物质的吸收能力 2 改变酶活 酶促反应的速率及代谢途径3 环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度 从而影响营养物质吸收 或有毒物质的毒性 三 pH值与微生物生长的相互影响 一 环境pH值对微生物生长的影响 微生物的生长pH值范围极广 从pH2 8都有微生物能生长 但是绝大多数种类都生活在pH5 0 9 0之间 二 不同微生物对pH要求不同 不同的微生物最适生长的pH值不同 根据微生物生长的最适pH值 将微生物分为 嗜酸微生物 硫杆菌属pH8 5 Aspergillusniger在pH2 2 5 有利于合成柠檬酸 当在pH2 5 6 5以菌体生长为主 而在pH7 0时 则以合成草酸为主 丙酮丁醇梭菌在pH5 5 7 0范围时 以菌体生长为主 而在pH4 3 5 3范围内才进行丙酮丁醇发酵 微生物生长最适pH合成抗生素最适pH灰色链霉菌6 3 6 96 7 7 3红霉素链霉菌6 6 7 06 8 7 3产黄青霉6 5 7 26 2 6 8金霉素链霉菌6 1 6 65 9 6 3龟裂链霉菌6 0 6 65 8 6 1灰黄青霉6 4 7 06 2 6 5 生长的最适pH值与发酵的最适pH值 三 微生物细胞内的pH值 虽然微生物生活的环境pH值范围较宽 但是其细胞内的pH值却相当稳定 一般都接近中性 四 营养物质五 水份 第四节微生物生长繁殖的控制 防腐 Antisepsis 防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长 化疗 Chemotherapy 杀死或抑制宿主体内的病原微生物 消毒 Disinfection 杀死或灭活病原微生物 营养体细胞 灭菌 Sterilization 杀死包括芽孢在内的所有微生物 一 控制微生物的物理因素 杀灭或抑制微生物的物理因素 温度辐射作用过滤渗透压干燥超声波 一 温度 当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用 一 温度 高温使蛋白质 核酸等重要生物大分子发生变性 破坏 以及破坏细胞膜上的类脂成分 导致微生物死亡 温度愈高 十倍致死时间愈短 一 温度 1 干热灭菌 烘箱内热空气灭菌火焰灼烧 干热灭菌 160 2小时 2 湿热灭菌 湿热比干热灭菌更好 更易于传递热量 更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构 2 湿热灭菌 1 巴斯德消毒 pasteurization 60 85 处理15秒至30分钟 2 煮沸消毒 3 间歇灭菌 fractionalsterilizationORtyndallization 低温长时法 LTLT 62 9 30min处理牛奶高温瞬时法 HTST 71 6 15s处理牛奶超高温巴斯德灭菌法 Ultrapasteurization 让液体食品停留在140 左右3 4s 急剧冷却至75 经匀质化后冷却至20 4 高压蒸汽灭菌 autoclaving 121 15 30分钟 115 20 30分钟 应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度例如 生理盐水 营养琼脂等培养基用121 适用 耐高温物品 玻璃仪器 含水或不含水的物品 含葡萄糖 乳糖 氨基酸等培养基用112 高压蒸汽灭菌锅 注意事项 排净冷空气 灭菌终了 缓慢降压 灭菌结束 趁热取出物品 低温 低温是通过降低酶反应速度使微生物生长受到抑制 1 冷藏法 5 微生物斜面菌种放置冷藏箱中可保存数周至数月而不衰竭死亡 食品保鲜 2 冷冻法 二 低温抑菌 三 辐射作用 辐射灭菌 RadiationSterilization 是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法 用于灭菌的电磁波有微波 紫外线 UV X 射线和 射线等 1 微波 微波的范围在915 2450MHz s之间机理 微波产生热效应 使蛋白质 酶等物质变性 导致微生物死亡 特点 加热均匀 热能利用率高 加热时间短 应用 食品消毒 灭菌 2 紫外线灭菌紫外线杀菌或诱变原理3 射线灭菌Co60放射性元素可放出 射线 四 过滤作用 空气和不耐热的液体培养基的灭菌 棉花 玻璃纤维或石棉 滤膜 核孔 实验室中常用的滤器 滤膜过滤器 蔡氏过滤器 玻璃过滤器 磁土过滤器等 过滤介质 醋酸纤维素膜 硝酸纤维素膜 聚丙烯膜以及石棉板 烧结陶瓷 烧结玻璃等 滤器孔径 常用0 22 m 0 45 m 应用 对于含酶 血清 维生素和氨基酸等热敏物质除菌 五 高渗 干燥等 1 干燥干燥能引起微生物细胞内蛋白质的变性和盐类等物质浓度提高 从而抑制生长或造成微生物死亡2 渗透压在高渗溶液中 细胞易失水 脱水后发生质壁分离 生长受抑制或死亡 盐渍和糖渍保藏食品 二 控制微生物的化学物质 一 消毒剂和防腐剂 一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质 防腐剂和消毒剂 特点 对一切活细胞都有毒性 不能用于人或动物体内的化学治疗 消毒剂 可杀死微生物 通常用于非生物材料的灭菌或消毒 防腐剂 能杀死微生物或抑制其生长 但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低 可作为外用抗微生物药物 常用的消毒防腐剂