[机械模具数控自动化专业毕业设计外文文献及翻译]【期刊】高度灵敏，高度可重复的激光诱导荧光检测系统-中文翻译

高度灵敏，高度可重复的激光诱导荧光检测系统 摘要 本研究，我们已经开发出一种新型激光诱导荧光检测（ LIF）系统，这是特别好，比如在毛细管电泳和微芯片为基础的分离和微反应器装置，如微流体过程测量的理想选择。为了获得高性能的系统，我们作为测量探头以及一个物镜致动器是在一个光轴的垂直和水平方向振捣根据一个简单的方法，市售的光学读取头。我们的系统优于传统的系统，因为它具有高灵敏度和高重复性，它可以在不复杂，昂贵的高精密组件和检测探头定位装置实施。 关键词 ：激光诱导荧光检测，激光头，音圈电机，振 动的方法，无需微调，灵敏度高，重现性高，成本低，结构紧凑，微流体设备。 1 引言 最近，使用小芯片生化分析性能吸引了比传统的系统，因为它的许多优点相当的重视。该芯片最具吸引力的特点是它的体积小。它的使用，确保反应快速，高效分离，减少了样品和分析所需的试剂可观。由于这种出色的功能，芯片也吸引了诸如环境监测，生命科学和医疗保健领域相当重视，因为在这些领域中使用的分析样品的数量相当小 1,2。但是，这些芯片体积小，同时要求非常高的检测灵敏度。 1 0957-0233/08/085404 10 $之间在微流体器件测量用于检测计划的不同类型的 30.00，激光诱导荧光（ LIF）方法被认为是最敏感的方法3-5 J.目前，有各种 LIF 系统可供选择，包括一个单分子在液体中的敏感性LIF 显微镜。但是，它是非常困难的发展离不开一个快速的检测灵敏度下降，小型和廉价的 LIF 系统。 2008 IOP 出版印刷有限公司在英国的实际执行，特别是在诸如医疗实验室免疫分析技术，测试芯片必须是一次性使用的芯片。可以有两种类型的 LIF 系统，一个系统，一个设备和一个集成芯片荧光检测系统组成（“综合型” ） 6或微芯片和检测系统（“分离式” ） 。后者的制度，如一次性使用的试纸，并使用自动化实验室设备，保证了便于分析实现的简单处理的技术优势。然而，在“分离式”系统，就很难保持相同的芯片之间以及与不同的芯片检测系统测量的相对位置，这会导致大量的实验误差。在传统的方法，高精度扫描阶段是必要的，以便调整之间的芯片和检测探头适当的相对位置。这一要求导致非常昂贵，大，重型设备。这种情况也使得它很难投入实际使用这个系统。因此有必要开发一种廉价和紧凑的系统，有一个简单的机制和高灵敏度和高重复性。 为了达到这个目的，我们开发了具有高灵敏度和高重复性相对便宜，紧凑的 LIF 系统。我们的系统使用了高数字化 1 光圈镜头作为测量探头市售的激光头。此外，物镜致动器是使用，它是在沿光轴的垂直和水平方向振动驾驶在适当的频率，同时用一个简单的方法方向的执行机构。例如，如果我们应用在微流体器件测量我们的系统中，光束焦点将移动在垂直和水平方向，然后扫描整个二维的微节在高速设备。因此，人们可以看到，测量结果可以用高灵敏度，高重复性和无之间的采样位置，芯片和检测头微调获得。因此，我们的微分析系统具有较高的性能，成本和空间效益。 图 1 设计试验装置：（一）顶视图和（ b）侧视图。 2 系统描述 2.1。微流体测试装置 在本节中，我们描述了微流体装置，是用来评估我们系统的性能。大多数微流体器件制作在玻璃或硅。 然而，许多是在聚合物基微流体器件的研究，目前正专注于宝 1 vdimethyl氧化硅甲烷（ PDMS） ，由于其成本低，易于操作。此外，一些研究报告 PDMS 为基础的微流体装置 7-9， PDMS 是光学透明的波长范围从 235 运行到近红外范围内，因此在整个可见光区的光学检测是可能的。 PDMS 的自体荧光也低比其他聚合物。 该测试设备制造过程的基础上， PDMS 11-14副本成型技术。我们将这个过程解释下。首先，为微流体设备主是发达国家使用标准光刻和湿法化学蚀刻技术：（ 1）通道的设计是由使用 Adobe Illustrator 10.0.3，然后印在透明薄膜是用作遮罩了。一个积极的光致抗蚀剂薄层（。 PMER P - RZ300：东京 Ohka工业株式会社，日本神奈川县）是在空白面具板（ Cr/CrQ2， 50 纳米 ; ULVAC 设备销售公司，日本东京。 ）表面涂层旋和随后暴露于长波的长度约 2 UL 通过与载玻片对准透明度分钟 traviolet 灯。 （ 2）取得 20 / XM 厚的微结构，光致抗蚀剂被允许发展中的显影液（ PMER P - 1S;东京 Ohka 兴业）的另外 2 分钟。与渠道设计模板进一步烘烤在 85 15 热板，以加强粘连分钟 C 和随后逐渐冷却 1-2小时至室温在这个过程中，所有的光阻去除除了抵制在定义的渠道领域。 （ 3）为了确保顺利脱模，玻璃幻灯片在 17 W / V 铈（ IV）二铵硝酸溶液中去除暴露镀铬层。漂洗后在 2 M HNO：“一个有大约 20 FTM 通道高度掌握被蚀刻在1 M NH4F/IM HF 25 分钟在 25下获得解决方案的玻璃，在 PDMS 芯片成型对主。 （四） PDMS 预聚物溶液（ Sylgard 184：道康宁东丽有限公司，东京，日本）浇到主用持有的解决方案框架。 （ 5）它是固化在烤箱在 65 1 h 后在 100 秒 1发彗星治愈之后。 （ 6）固化后的 PDMS 芯片去皮 O ：玻璃的主人，并用直径1.6 主席访问孔分别到芯片打了个使用金属管。 （ 7） PDMS 芯片是不可逆的键合 1.2 毫米等离子氧治疗两个表面厚玻璃板，然后才接触到 9提出。随后硅管插入孔的访问和 PDMS 粘。图 2 显示了制造测试设备。 m mJL 图 2 外观的制造测试设备。 2.2光学检测系统 现在，我们详细解释了光学检测部分。对我们 LIF 系统原理图描述如图 3所示。为荧光激发光源是连续 Nd： YAG 倍频带的 532 NRN（ = AI） ，一个光束直径为 1.2 毫米， 9.75 毫瓦的输出功率为 1，保证功率稳定波长的激光。在带宽峰峰值噪声从 DE 到 50 兆赫不超过 0.1（ MSL - 532，长春新产业。中国） 。激发光束穿过 25的中性密度（ ND）滤镜（输出功率为 2.43 毫瓦） ，并通过微型电磁机械切碎活塞行程为 5 mm（ PI 105A， TDK 公司，日本东京） ，其中弧要避免荧光光漂白的样品。活塞最大的斩波频率为 60 赫兹。光束经过束分离器和一个 1 / 4 波长板。它是那么反射前被转移了 0.45 数值孔径 NA（传出）和焦距为3.17 毫米 /一个光头物镜二色镜。梁，然后集中到一个小点，并预计到样品。梁力之三值自动对焦镜头，通过客观的逝世是 1.87 兆瓦，光斑大小为 0.97 /。英里。一个样品架，这是作为一个为测试设备定位指南中使用，是摆在上面的光学检测部分物镜。步进电机是安装在持有人方和测试设备，它是在持有人设定，定位精度为 40 ，在水平（ X）的方向和 20 IM 在垂直（ Z） IM 方向穿过通道。对于多通道测量，渠道之间的测试设备和物镜驱动器中的无梁运动的立场是大约 1.51 毫米。聚焦光吸收和排放，从在一个较长的波长（ = 2）根据斯托克斯位移样品荧光光了。这种荧光收集的一个有 0.60（迁入） NA 皮卡物镜。在光锥可以用此物镜收集 10.0 的总 4tt 立体角，在假设发射光子辐射四面八方。下面的两色镜子，反映了 550 万（ = 3）波长的光并传送超过这个波长的光，从而只传输一个荧光光谱。 接下来，光线过滤再次使用的排放过滤器，即一个带通滤波器，只传输的荧光发射波长，检测使用光电倍增管（ PMT R6355; Hamamat.su 光子学株式会社，日本静冈县） 。在输出路径，一个自制的圆锥型为 2 毫米 x 4 毫米口径光学挡板组装，以减少在沿 X - direetion 流浪检测的反射和散射的结果是自动控制步进在 5 毫米间隔马达，最大速度为 20 毫米的 “1。地面之间的工作距离板底部的重复执行，并为每个通道中的所有周期的最高值的平均值作为最后的考虑测得的该通道的荧光信号值，应该指出的是，它有可能实现高通量的测量，因为数据采集和数据分析在测量过程中的往复循环执行，在下一节中，它是观察到的振动方法中起着重要的作用。 图 3 对我们 LIF 系统原理图描述光学拾音 图 5。 开环的光学拾音物镜致动器的动态响应特性：（一）转让为特征的重点方向和（ b）转移轨道的方向特性。 频率 Hz聚焦 至于执行测量准备，第一，在物镜致动器扫描范围应设置检测之间的通道要解决和玻璃板或 PDMS 盖板的界限。之间的空白溶液和玻璃地面板或空白溶液和 PDMS 盖板的重点方向边界可以由 astigmatieally 检测的重点错误信号 S 形曲线。之间的空白溶液和 PDMS 盖板的轨道方向边界可以由监察沿地面之间的玻璃板块与板块边界 PDMS 盖反射信号的强度。因此，通过执行此操作，可以设置在两个轨道的重点和方向的 VCM 扫描范围。虽然这一边界检测预扫描步骤是在情况下的深度和宽度的微不明有效的，它不一定需要我们的实验，因为深度和微通道宽度是已知的，和（ 40 精度粗糙调整 IM 和 20 / X 和 Zdirections，分别和 20 /双向 IM 准确性 IM）已经完成用步进电机的样品架。因此， VCM 运动范围可以预先设定，以涵盖所 有具有足够余量的 mierochannels 二维部分。我们采用以下方法进行振动。这种方法特别适合于微芯 片为基础的测量。在这项研究中，我们使用高精度，同步扫描三角信号，从积极的 V 以适当的频率，在焦点（ Z） 和跟踪（ X）方向负 V2。该信号的频率决定的基础上，条件是为 Z 方向 (=/)振动频率高于对 X 方向 (=/:).在我们的系统中，信号是由一个 DA 转换器，以 4 MHz 采样率 16 位分辨率与来自控制单元的输出数据进行。因此， VCM 沿 X 方向移动物镜反复扫描，而它沿同步 Zdirection 振动。作为一个结果，光斑扫描的mierochannels 整个二维高 速移动的光束的焦点部分。在此测量过程中，最大测量中的每个 Z 方向往复运动值由实时采集使用控制单元的数据分析。同样的程序执行为 X 方向同时具有较低的振动频率。的往复循环，然后实现高通量的测量，因为数据采集和数据分析在测量过程中的往复循环执行。在下一节中，我们可以观察到的振动方法中起着重要的作用，改善测量灵敏度和重现性不执行之间的 microchanncls 和我们 LIF 系统的检测探头的相对位置进行微调。 3 实验部分 3.1。测量过程概要 在测量过程中，我们应用我们的大纲 LIF 系统的微流体测试装置在 2.1 节中所述，从而评估了我们的系统性能。作为评价样本，我们使用 Resorufin。它被广泛使用，直接或间接地为与吸收和荧光发射最大值 563 nm 和 587 nm 的荧光蛋白质标记 DVE 分别。与 Resorufin 不同浓度样品溶液制备稀释用 0.1 M 磷酸缓冲液， pH 7.4（ 1:1， V / V）混合，然后添加到系统的样本库。该试验装置被放置在样品架，这是放在高于 LIF 系统物镜（图 3 右）约 1.51 毫米。该设备被连接到由 PEEK 管注射泵和样品溶液泵在 20 流量 / IL 分钟“从 1 到每个通道的水库，流速稳定性为 0.1，然后在荧光信号绑定到流通渠道，测定样品溶液的 LIF 使用振动的方法在 2.3 节中描述的系统。在测量过程中，对流通渠道之间的连续梁的运动是由步进电机进行了 20 毫米的速度上线由控制单元，因此多渠道在测试设备 的样品进行了测量命令的基础上很快在我们的实验中，我们设定 V - 0.5 V， V2 = -0.5 V， / J = 400 Hz 和 / 2 = 40 Hz 的考虑，测试设备是与 40 庵在 X 方向和 20 / . .在 Z 方向定位精度 IM 的检测到的卷的最大数量，由物镜的数值孔径决定束腰的大小和通道距离计算约为 400 PL，这种小批量的检测，是本系统的优良特性之一。 3.2 重复性的改善 首先，我们评估在因之间的微芯片和光学检测探头的相对位置误差荧光信号的测量值的变化。由于激光光斑尺寸很小，彼此之间的通道和物镜的相对位置已经对输出信号的强度，因此对测量结果有相当的影响力。测量结果均用五种不同的芯片和一个 1.0 10“7 M Resorufin 的解决方案。为了比较的目的，势必流道 1 Resorufin 荧光信号的解决方案都是为当物镜固定在测量的情况下初始位置和目标时的镜头是在 / I = 400 Hz 和 / 2 = 40 赫兹（实验 1） 。频率振动情况，那么，绑定到所有五个渠道 Resorufin 解决方案的荧光信号进行测量移动沿 X 方向的芯片，以评估之间的通道（实验 2）的变化，在这些实验中，十进行测量每个实验采取的芯片和每个芯片之间的通道束的运动了沿 X 方向是自动控制在 5.0 毫米的步进电机的间隔，应该指出的是，每个芯片是由人的手在采样安装，结果如图 6 所示（实验 1） 8 网图 7（实验 2）从图 6（ a）可以看出，在测量值的变化是大的物镜时是固定的，即使是初步优化，它有时会出现所观察到的，通过把信号变得很弱微芯片和缩小，也就是说，重点不交 3。实验部分 3.1 测量过程我们采用的 LIF 系统的微流体测试装置在 2.1 节中所述，从而评估了我们的系统性能大纲，作为一种评价样本中，我们使用Resorufin，因而被广泛使用，直接或间接地为与吸收和荧光发射最大值 563 nm和 587 nm 的荧光蛋白质标记 DVE，分别与不同浓度的 Resorufin 样品溶液是由串行准备用 0.1 M 磷酸缓冲液， pH 值 7.4（ 1:1， V / V）混合，然后稀释添加到样品库系统，测试设备是在样品架，它被放在上面放置约 1.51 毫米物镜的 LIF系统（图 3 右） 。设备被连接到由 PEEK 管注射泵和样品溶液泵在 20 流量 / IL 分钟“，从水库到每个通道 1。流速稳定性为 0.1。然后，必将对流通渠道的样品溶液的荧光信号进行测量振动的 LIF 使用方法在 2.3 节中描述的系统。在测量过程中，对流通渠道之间的连续梁的运动是由步进电机进行了有关命令，由控制单元的基础上速度为 20 毫米 s 和因此多通道测量在测试设备 的样本表现非常迅速。在我们的实验中，我们设定 V - 0.5 V， V2 = -0.5 V， / J = 400 Hz 和 / 2 = 40 Hz 的考虑，测试设备是与 40 庵在 X 方向和 20 /精密定位， IM 在Z 方向。对检测到的卷的最大数量，由物镜束腰尺寸和数值孔径的通道距离确定计算约为 400 PL。这种小批量的检测，是本系统的优良特性之一。 3.3.测量结果 接下来，我们显示了我们的 LIF 检测系统特性的测量结果。该测量均对不同浓度的 Resorufin 解决方案。该 LIF 系统响应 Resorufin 不同浓度见图 8。我们可以观察到的 Resorufin 响应曲线覆盖超过四个数量级，并在测量线性范围 0.1 - 100 纳米。而测量精度为 0.99 K2 超过了便携式测量仪器的标准值0.95。测量时间，不计时间收拾在 PDMS microehannel 样品溶液，只需不到 10秒。检测限约为 800 分在 3 信号的信噪比。绝对的样品检出量为约 320 zmol，从样本估计虽然在 Resorufin 响应曲线的测量，得到来自五个不同的渠道和五个不同的芯片，在这个范围内 RSD 值表示的重复性非常好： 1.4 不同渠道和芯片至芯片测量，在测量进行十次（ N - 10） 2.1的单芯片测量。结果更令人印象深刻的考虑，每个芯片为 F abricated 单独和每个芯片是手工安装在实验装置。因此，我们的系统可以分析具有高灵敏度和振动不定位 microehannel 恰恰是一个光头物镜高重复性的样品溶液。因此，我们开发了一个相对较小的高性能和廉价的分析系统。我们的系统可以方便地实现实际，特别是在医学实验室等，其中的测试芯片必须是一次性使用的芯片，即免疫分析技术，该系统包括一个一次性芯片和光学检测系统。在这些“分离式”系统，它是难以执行高重复性由于在芯片之间和不同的测量检测探头位置误差高度敏感的测量。这意味着我们的 LIF 系统非常适合的“分离式”系统，因为它可以提供成本，时间和空间，有效的测量和高性能由于简化测量过程与激光头的使用。这也是必要的。考虑的 . effect.of.，色 .分散在我们的光学系统。我们的光学拾音镜头是专为 650 nm/780 波长。因此，读写头造成轴向激发和荧光的波长，这是（缩短焦距）重点转移的结果色差。然而，这种转变并不影响我们的扫描结果的方法和我们曾经是物镜扫描范围是为激发波长决定的。因此，色散不会导致在出LIF 系统性能严重退化和。我们能获得高灵敏度和重复性的结果。我们现在考虑所取得的成果时， LED 作为光源的采用。在我们的研究中，我们使用的最大排放 myjdengtfa 为 525 纳米， 40 纳米半带宽， 15 个方向性的角度和一个 3.10毫瓦的输出功率 LED 绿色（ NSPG500S; Niehia 公司，日本德岛） 。后通过物镜近光功率为 0.15 兆瓦，约为总功率的 4.8。图 9 显示了在这种情况下，为Resorufin 校准曲线。人们可以看到，检测限为在 3 信号与噪声的比例，这是约 20 分贝外，在图 8 所示的情况下少约 11 海里。虽然灵敏度相对较低的情况相比，使用激光作为光源，它必须考虑到，这个替换提供了一个优势，该系统的规模变得非常紧凑，因此它的价格大幅降低。这可能是有益的，比较单位的激光功率的灵敏度和 LED. 结论 LIF 一种新型系统，用来作为测量探头市售的激光头的开发。该系统的性能进行了评价 LIF 通过使用 20 / IM 渠道深度 Resorufin 解决方案和测试芯片：芯片是由粘接 PDMS 和玻璃制造。据证实，通过使用一个光头和一个简单的振动的方法，测量系统的重复性，可以大幅度提高，而且足以弥补从安装位置和运动而产生错误的芯片。我们研究了不同浓度的微芯片使用相同的方法对Resorufin 振动系统的响应。所获得的响应曲线是在测量范围 0.1-100 nM 的线性，检测限被发现为 3 信号与噪声的比例约为 800 分（ 320 zmol） 。这相当于常规系统。在重复测量的 RSD 值（ N - 10）表示的重复性为 1.4的单芯片测量和2.1 芯片到芯片的测量。这些结果是非常令人印象深刻的考虑，每个芯片单独制作，每个芯片是手工安装在实验装置。它表明， LIF 系统特别适合于在其灵敏度和重复性查看微流体器件测量的理想选择。因此，该系统可以有效地用于微芯片化学，这就需要对极少量样品的准确检测分析。我们的系统是有用的，不仅对研究和发展的目的，而且，如环境监测，生命科学和医疗的实际应用可取的，因为它比较便宜，结构紧凑，执行快速测量。目前，我们正在开展一项关于一种利用荧光蛋白质类型的诊断分析研究。我们应用我们的系统的免疫化学检测分析的定性测定。在我们的下一个文件，我们将报告对我们的 LIF系统应用到这样的例子详细的分析。 References 1 Krmer P M 1996 Biosensors for measuring pesticide residues in the environment: past, present, and future AOAC Int. 79 1245-54 2 Morgan C L, Newman D J and Price C P 1996 Immunosensors: technology and opportunities in laboratory medicine Clin. 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