实验十二--DNA的限制性内切酶酶切分析.doc

实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析课程名称：生物化学与分子生物学实验课 年级：2006 专业、层次：临床医学本科 授课教师：许成山职称：讲师 学时：4学时基本教材：自编 生物化学与分子生物学实验指导教学目的与要求：1、实现DNA的体外重组，鉴定Bcl-2重组质粒中的插入片段。2、学会设计构建体外重组DNA分子，根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶以及DNA的酶切技术。大体内容与时间安排：1、DNA限制性内切酶酶切分析与琼脂糖凝胶电泳的原理 10min2、DNA琼脂糖凝胶电泳的操作过程（录像） 5min3、EcoR酶切操作步骤的改动注意事项 5min4、学生做实验 140min教学方法：讲授式+启发式教学重点、难点：重点：1、DNA限制性内切酶酶切分析与琼脂糖凝胶电泳的原理2、DNA限制性内切酶酶切分析的注意事项难点：DNA限制性内切酶酶切分析的原理一、实验原理（一）EcoR酶切重组质粒Bcl-2的原理：限制性内切酶(restriction endonuclease，RE)是由细菌自己产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型：、和型，型酶就是通常所指的RE，能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。它是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。临床上某些遗传病是由于基因的缺失或插入或突变所致，可造成RE酶切位点的改变，故当用一定的RE切割时，其切开的片段(分子量)大小与正常人发生差异，即DNA限制性图谱发生改变，据此可达到基因诊断的目的。实验可选用价格低廉、酶切效果好的EcoR(识别位点GAATTC)对DNA进行酶切，观察RE的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生分子量分别为21 226bp，7 421bp，5 804bp，5 604bp，4 878bp和3 530bp片段。本实验是将实验十制备的人Bcl-2重组质粒DNA作为EcoR酶切底物。人Bcl-2重组质粒是EcoR单酶切的pBluescriptKS(-)载体与EcoR单酶切的人Bcl-2 cDNA重组而成的，大小为4 861bp，前者是一种由pUC19质粒衍生而来的具有2 961bp的质粒载体。因此用EcoR酶切则应得到空载pBluescriptKS(-)载体(2.96kb)和人Bcl-2 cDNA (1.9kb) 两个片段。经琼脂糖凝胶电泳后可较容易鉴定鉴定该质粒中的插入片段。（二）琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等)，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料SYBRGreen I结合，在紫外灯下可看到亮绿色荧光条带，籍此可分析实验结果。二、操作步骤1、 取Eppendorf管一支，在管中按下表依次加入：组分体积消毒三蒸水2.5 l10buffer H1.5 l质粒 DNA10 lEcoR（4U/l）1l反应体系：15 l2、加盖，混匀后稍离心，37水浴反应1 h。3、制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量，见表。表 琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系凝胶中的琼脂糖含量%(w/v) 线性DNA分子的有效分离范围(kb) 0.3 560 0.6 120 0.7 0.810 0.9 0.57 1.2 0.46 1.5 0.23 2.0 0.12称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1TAE缓冲液60ml，置微波炉或水浴加热至完全熔化，取出摇匀。4、灌胶(1) 取洁净的电泳内槽(又称托盘)，用橡皮膏或透明胶带将内槽的两端边缘封好(一定要封严，不能留缝隙)。(2) 将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。(3) 将冷却至60左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破。(4) 待胶凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明胶带，将带凝胶的内槽放入电泳槽中，注意凝胶点样端要靠近负极。(5) 加入1TAE缓冲液至电泳槽，缓冲液刚没过凝胶表面即可。5、加样 剪取适当大小的蜡膜(Parafilm膜)，取6荧光上样缓冲液2l点于膜上数点。取5l酶切后的样品，0.51g未酶切质粒DNA，DNA分子量标准分别与荧光上样缓冲液混匀。将其分别加入凝胶的点样孔(记录点样顺序及点样量)。6、电泳 接通电源槽与电泳仪的电源(检查正负极，DNA片段是从负极向正极移动)。DNA的迁移率与电压成正比，电压不超过5V/cm凝胶长度。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿12cm处，切断电源，停止电泳。7、观察结果 取出内槽，在紫外分析仪的玻璃平板上小心推出凝胶，通过防护屏或戴防护眼镜观察紫外灯透射的结果，DNA存在处应显出亮绿色荧光条带，可观察到酶切与未酶切后的DNA带的泳动位置。三、注意事项1、本实验可先进行酶切反应，酶切过程等时间的间隙灌好琼脂糖凝胶。2、进行DNA酶切时，要在其最适温度下(大多数为37)进行。最好是用每一种酶的专用缓冲液，以达到最佳酶切效率。如遇2种酶酶切应先用低盐缓冲液后用高盐缓冲液，或一种酶切结束后加TE至400l，再进行酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，重新建立第二个酶切反应体系。3、RE一定要在低温(20)下贮存，因含50%甘油，在此温度下一般不会结冰，如结冰则表明冰箱温度低于20，应避免结冰。新购的大包装酶，应先分装。每次吸取后均应将RE管放在冰盒内，用完后立即放在20，每次取酶尽可能使用新的灭菌tip，避免污染。4、进行大量酶切时，先要确定RE的浓度。一般1U RE于37条件下作用底物DNA 1h以上可切割1g DNA。一般来说，要用23倍才能保证完全消化，对基因组DNA尤其如此。5、酶切基因组DNA是否完全可通过紫外观察结果来判断，如看到DNA片段呈均一递减的一条区带，则表示酶切完全。6、对多个样品基因组DNA分别酶切电泳摄影，绘制出多个样品的DNA限制性内切酶图谱，即可分析作出基因诊断。四、思考题1、如何利用A260计算DNA的含量？2、 A260 / A280 的正常参考值是在哪个范围，这个比值有何意义？如果A260 / A280 1.8 说明了什么？如果A260 / A280 2.0 又说明了什么？3、DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？如果有，请说明原因小 结限制性核酸内切酶能特异地识别双链DNA中的碱基序列，通过“切割”双链DNA中每一条链上的磷酸二酯键使DNA断裂。利用它可方便地按需要对DNA进行“剪切”加工。限制性核酸内切酶单位的定义为：在限定的温度和反应环境中，1小时消化1g DNA所需的酶量为一个酶单位。由于种种原因，在实际使用时需适当增加增加酶量。现在一般用35单位的酶消化1g NDA；反应时间亦可延长到3小时以上乃至过夜；从而使得酶切反应更为完全。内切酶一般均保存在50%的甘油缓冲液中，但进行酶切反应时，过高的甘油浓度会抑制酶活性。在反应体系中甘油的终末浓度不能高于5%，故酶储存液至少需稀释10倍。通常各种核酸内切酶反应都需要Mg