生化与分子生物学实用技术.ppt

分子生物学实验技术总体设计 时间 周二8 30 10 00地点 309室内容 讲授 1 重组DNA的实验方案2 相关概念3 目的基因的获得 cDNAmRNA提取 PCR 酶切位点 实验 上午1 mRNA提取2 PCR下午3 电泳 分组操作 时间 周三地点 309室实验 上午1 PCR产物纯化回收 分组操作 2 酶切 分组操作 3 电泳4 切胶回收下午1 连接2 转化 分组操作 时间 周四地点 309室实验 下午 质粒提取 分组操作 酶切电泳 略 主要知识点 基因重组的概念及过程 用于重组DNA技术的理想载体应该具备的特点 获得目的基因的途径 真核表达体系的优点 常用真核细胞转染方法的种类 RT PCR的基本实验步骤 包括PCR 限制性内切酶的特点 重组DNA技术RecombinantDNATechnology 重组DNA技术相关概念 克隆 clone 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合 获取同一拷贝的过程称为克隆化 cloning 即无性繁殖 DNA克隆 技术水平 分子克隆 molecularclone 即DNA克隆细胞克隆个体克隆 动物或植物 DNA克隆应用酶学的方法 在体外将各种来源的遗传物质 同源的或异源的 原核的或真核的 天然的或人工的DNA 与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子 复制子 replicon 继而通过转化或转染宿主细胞 筛选出含有目的基因的转化子细胞 再进行扩增提取获得大量同一DNA分子 也称基因克隆或重组DNA recombinantDNA 目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物 蛋白质 基因工程 geneticengineering 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程 又称重组DNA工艺学 重组 DNA 技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因 外源基因 基因组 DNA cDNA 人工合成 PCR 产物 限制酶消化 开环载体 DNA 目的基因 转化 体外包装 转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 目 录 鉴定 测序 以质粒为载体的DNA克隆过程 目录 载体 定义 能够携带外源基因并且具有自主复制能力的DNA 是将目的DNA导入受体细胞的工具 在重组DNA技术中 常用基因载体有两种类型 克隆载体表达载体 载体的特点 具有自主复制能力 保证重组DNA分子可以在宿主细胞内得到扩增 具有较多的拷贝数 易与宿主细胞的染色体DNA分开 便于分离提纯 具有一个或多个筛选标记 如对抗生素的抗性 营养缺陷型或显色表型反应等 便于重组体的筛选和鉴定 有克隆位点 外源DNA插入点 常具有多个单一酶切位点 称为多克隆位点 便于目的基因的克隆 分子量相对较小 易于操作 以容纳较大的外源DNA 具有较高的遗传稳定性 使用安全 载体种类 1 质粒 plasmid 2 噬菌体 phage 3 柯斯质粒 粘粒 cosmid 4 人工染色体 细菌人工染色体 bacterialartificialchromosome BAC 酵母人工染色体 yeastartificialchromosome YAC 哺乳动物人工染色体 mammalianartificialchromosome MAC 5 动物病毒DNA改造的载体 如腺病毒 腺病毒相关病毒 逆转录病毒 质粒 plasmid 特点能在宿主细胞内独立自主复制 带有某些遗传信息 会赋予宿主细胞一些遗传性状 细菌中独立于染色体外的双链闭环DNA分子 目的基因的获取 1 化学合成法 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 2 基因组DNA文库 genomicDNAlibrary 3 cDNA文库 cDNAlibrary 4 聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR 5 从已有重组载体中获得 目录 聚合酶链反应PolymeraseChainReaction以拟扩增的DNA分子为模板 以一对分别与模板5 末端和3 末端相互补的寡核苷酸片段为引物 在DNA聚合酶的作用下 按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成 重复这一过程 即可使目的DNA片段得到扩增 这一过程成为PCR 模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶 Taq酶 dNTPsMg2 PCR体系基本组成成分 PCR的基本反应步骤1 变性 将反应系统加热至95 使模板DNA完全变性成为单链 2 退火 将温度下降至50 左右 使引物与模板DNA退火结合 3 延伸 将温度升至72 DNA聚合酶以dNTPs为底物催化DNA的合成反应 上述三个步骤为一个循环 经25 30次循环后 可将模板DNA扩增达百万倍 PCR的基本反应步骤 变性95 C 延伸72 C 退火50 C 5 Primer1 5 Primer2 Cycle2 Cycle1 5 5 5 TemplateDNA 5 5 5 一 基本工作原理 目录 5 5 5 5 5 5 5 目录 Cycle3 重组DNA技术的基本过程及技术路线 分 获取目的基因切 限制性内切酶接 连接目的基因及载体转 重组子转入宿主细胞筛 筛选出含有重组子的宿主细胞 mRNA提取 cDNA PCR 琼脂糖电泳 RT PCR 凝胶中回收PCR产物 目的DNA与载体双酶切 DNA与载体的连接 转化 质粒的提取 酶切鉴定 测序 表达 以构建pBSK Akt1 WT重组体为例 一 PCR扩增得到Akt1 PKB的cDNA设计基因特异性引物a b 以克隆在质粒pCIS2 Akt1上的Akt PKBcDNA为模板5 端引入Hind 酶切位点 3 引入BamHI酶切位点 以a b为引物 扩增野生型Akt1 PKB 引物a 划线部分为Hind 酶切位点 5 GCGAAGCTTCCATGAACGACGTAGCCATTGT 3 引物b 划线部分为BamHI酶切位点 5 ATTGGATCCTCAGGCTGTGCCACTGGCTGAG 3 PCR产物末端限制酶切位点的切断情况 10 PCR反应缓冲液5 0 ldNTPmix 2mmol L 4 0 lExTaqDNA聚合酶 5U l 0 25 l引物a 10pmol l 2 0 l引物b 10pmol l 2 0 lpCIS2 Akt15ng加水至50 l 应用TaKaRaExTaqDNA聚合酶 反应体系为50 l 94 预变性1min 然后按照94 30sec 63 45sec 72 1min 进行29个循环 最后72 延伸10min 电泳检测PCR结果 PCR产物的回收和鉴定 将上述PCR产物全部电泳 然后按照TaKaRaDNA凝胶回收试剂盒的说明书回收PCR产物 电泳检测回收的PCR产物 二 PCR产物和表达载体的限制性内切酶酶切 1 酶切体系的组成及注意事项 内切酶 根据实验的目的选择限制性内切酶 对于基因克隆 选择粘性末端可提高连接效率 DNA DNA应该具备一定的纯度 其溶液中不能含有过量的酚 氯仿 乙醚 大于10mmol L的EDTA SDS以及过量的盐离子浓度 以免影响限制性内切酶的活性 反应缓冲液 每一种限制酶都有其一系列最佳反应条件 甚至来源于不同厂家的同一种限制酶的反应缓冲液也不尽相同 应该严格遵照产品说明书进行操作 2 限制酶操作时应注意的原则 限制性内切酶从冰箱中取出后 应置于冰中 一般总是在其它试剂加完后 再加入内切酶 必须使用新的灭菌吸管 1个吸管不能反复使用 更不可交叉使用 内切酶的容积不能超过反应总容积的10 否则使甘油终浓度达到5 将会抑制酶在该体系中的活性 酶应分装成小份 当切割大量DNA时 通常用延长反应时间来减少酶的用量 同一种内切酶消化多个DNA样品时 应计算所需酶的总量 再将酶稀释液分配到各个反应管中 以减少酶液储存管的污染机会 PCR产物 或pBluescriptII SK 12 l10 Y Tanqo withBSA 2 lHind 10U l 1 5 lBamHI 10U l 1 5 l补水至20 l 三 PCR产物与载体的连接 建立连接反应时注意 1 温度 粘性末端的连接一般在16 进行 以保证粘性末端退火及酶活性 反应速率之间的平衡 2 酶量 3 DNA量 载体与目的DNA的分子数比例一般为1 3 四 重组体导入受体细胞 受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态 competent 导入方式转化 transformation 转染 transfection 感染 infection 在重组DNA技术中转化 将质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程 转染 病毒及其重组子导入真核受体细胞转导 噬菌体及其重组子导入受体细胞 真核细胞转染的方法 脂质体法磷酸钙法电穿孔法DEAE葡聚糖法显微注射法 转化步骤 将60 lE coliJM109感受态细菌置于冰上溶化 加入2 l重组体 冰上放置30分钟 42 水浴90秒 迅速放入冰中骤冷3分钟 加LB培养基至1ml 轻轻摇荡 37 振荡培养1 5h 使得细菌恢复正常并让氨苄青霉素抗性基因表达 五 重组体的筛选与鉴定 直接选择法 1 抗药性标记选择 2 标志补救 如蓝白筛选 3 分子杂交法 原位杂交Southern印迹免疫学方法 利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选 如免疫化学方法及酶免检测分析等 1 筛选阳性菌落并扩大培养 取150 l转化后的液体涂布于Amp 的琼脂平板培养基中 37 培养过夜 挑取单菌落于Amp LB培养基中 37 振荡培养过夜 2 碱裂解法提取质粒DNA 原理 在pH12 0 12 6碱性环境中 线性的大分子量细菌染色体DNA变性 而共价闭环质粒DNA仍为自然状态 将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下 染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构 大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀 而共价闭环质粒DNA仍为可溶状态 通过离心 可将去除大部分细胞碎片染色体DNA RNA及蛋白质 质粒DNA尚在上清中 再用酚 氯仿抽提进一步纯化质粒DNA 试剂 溶液I 50mmol L葡萄糖 25mmol LTris HCl pH8 0 10mmol LEDTA溶液II 0 2mmol LNaOH 1 SDS 此溶液必须新鲜配制 溶液III 5mol LKAc60ml 冰醋酸11 5ml 水28 5ml 配制好的溶液III含3mmol L钾盐 5mol L醋酸 pH4 8 酚氯仿乙醇TERNase 步骤 取1 1 5ml细菌培养液移至Ep管中 12000g 4 离心1分钟 弃上清 将细菌沉淀悬浮于100 l冰预冷的溶液I中 强烈振荡沉淀 加入200 l溶液II 盖严管盖颠倒微型离心管5次以混合内容物 不要强烈振荡 放置冰上5 10分钟左右 加入150 l溶液III 可以将管盖朝下温和振荡10秒钟 冰上放置3 5分钟 4 12000g离心 5 10min 取上清移至另一Ep管中 加入等体积的酚 氯仿抽提 振荡混匀 4 12000g离心2min 取上清移至另一Ep管中 用2倍体积的乙醇 振荡混匀 室温放置2分钟 12000g 4 离心5分钟 弃上清 加入1ml70 4 乙醇振荡漂洗沉淀 12000g 4 离心2分钟 弃上清 将Ep管倒置放在滤纸上 室温干燥沉淀 用50 l含有无DNA酶的RNA酶 20 g ml 的TE重新溶解核酸 温和振荡几秒钟后可进行内切酶酶切实验或贮存于 20 3 重组质粒酶切鉴定 重组质粒用Hind 和BamHI双酶切 反应体系如下 质粒DNA5 l10 Y Tanqo withBSA 1 lBamHI 10U l 0 5 lHind 10U l 0 5 l加水至10 l酶切反应结束后 电泳检测酶切结果 DNA重组技术 原核表达与真核表达体系 大肠杆菌是常用的原核表达体系 具有遗传背景清晰 成本低廉 表达水平高的优点 真核蛋白常具有翻译后修饰加工 比如糖基化 磷酸化 乙酰化 多聚化 二硫键形成等等 在原核表达体系中 不能完成这些翻译后修饰加工 常常使一些表达的真核蛋白没有活性 而真核表达系统具有翻译后修饰加工的能力 常可获得有活性的表达蛋白 实验一 组织总RNA的提取 试剂 RNAout 氯仿 异丙醇 75 乙醇 RNAsefree水 步骤 1 将组织样品剪碎 2 按50 100mg组织加1ml的RNAout 匀浆30秒 3 按每1ml的RNAout加入0 2ml氯仿 涡旋震荡30秒 4 离心13000转 分 3分钟 5 取上清液 约0 6ml 转移入新的EP管 注意 取上清要避免吸入中间层 防止DNA或蛋白质污染 6 上清液中加入等体积异丙醇 涡旋震荡30秒 7 离心13000转 分 5分钟 8 小心弃上清 9 EP管中加入1ml的75 乙醇 震荡30秒 10 13000转 分 离心1分钟 11 小心弃上清 12 重复9 11步一次 13 短暂快速离心 吸弃残留乙醇 注意 尽量不要残留乙醇 会影响到RNA的使用 14 室温放置1 2分钟 加入RNAsefree水50ul溶解 注意 应使用无RNAse的水溶解RNA 15 RNA的浓度与纯度测定 OD260 1 40ug ml OD260 OD280 1 8 2 1 实验二 RT PCR 1 试剂 通用型RT PCR试剂盒 2 RT的反应体系 20ul 溶液A 随机引物RP