细胞培养的基本知识.ppt

医用细胞工程 概念 根据细胞生物学和工程学原理 运用体外细胞培养技术定向改变细胞遗传特征 建立或创建新型细胞系 株 通过专门的细胞培养方法研究细胞生命现象和活动规律 采用工程化的的大规模细胞培养方法和工艺 制造医用生化和生物制品 第1章细胞培养的基本知识 本章主要内容 基本概念和名词细胞的特性 第一节基本概念和名词 细胞培养 cellculture 技术 细胞系 cellline 细胞株 cellstrain 克隆 clone 一 基本概念 细胞培养 cellculture 技术 即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术 是广泛应用于医学研究领域的重要技术 细胞系 cellline 系原代培养经首次传代成功后即成细胞系 由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成 细胞株 cellstrain 系通过选择法或克隆形成法 从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的细胞群 细胞株的这种特定性或标志必须在整个培养期间始终存在 克隆 clone 系指由同一个祖先细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体 二 活体的体外培养技术 细胞培养技术 组织培养技术 活体的体外培养技术 器官培养技术 一 组织培养技术 人和动物 昆虫及植物的某组织在试管中培养成活的生物技术 特点 细胞不从组织中失散 保持与组织原来的关系 将组织分散或从组织中分离活的细胞 在体外进行培养和传代 特点 组织失散 只有细胞和派生细胞的关系 细胞培养和组织培养不是绝对的分开 有交叉 二 细胞培养技术 三 器官培养技术 将器官切成几立方毫米大小 保持器官原有的结构和功能的培养 特点 能短期存活 不能长期传代需用组织切片 透射和扫描电镜观察 1 群体培养 大量细胞置于同一培养瓶中进行贴壁或悬浮培养 2 克隆培养 挑选单个细胞或单一集落 克隆 于体外进行培养 常用于细胞克隆化 纯化 建立细胞株 长期传代 四 培养方式 五 细胞培养的优点 1 能长期传代 保持活性 便于监控检测结构功能和生命活动 2 培养条件可以人为的控制便于研究细胞代谢 物理 化学 生物因素的影响3 可用于各种观察和检测手段研究活细胞的变化 变异 分化 可从细胞水平开展亚细胞结构和代谢分子的表达 4 研究范围和细胞来源广泛 选择性广 5 不同代次细胞可长期保存 既可开展同代次不同条件和方法研究 又可观察不同代次的动态变化 6 耗资少 经济 成本低 可大量培养利于生物制品的生产 第二节细胞的特性 一 培养细胞的形态 形态上表现为多种多样 如呈圆形 椭圆形 正方形 柱形 扁平形 梭形 星形和多边形等 细胞内的中心粒 高尔基体 细胞内的粗面内质网 心肌细胞内的线粒体 二 培养细胞的生长方式和类型 贴壁型生长细胞 培养细胞的生长方式和类型 悬浮型生长细胞 半贴壁生长细胞 一 贴壁型生长细胞 需贴附于底物表面生长称为贴壁性或锚着依存性细胞 需消化散传代利于观察细胞形态 结构 二 悬浮型生长细胞 无需附着物的支持表面 呈悬浮状态生长 呈圆行形 一接团块优点 生存空间大 与培养基充分接触无需消化传代 利于大量生产 贴壁细胞经悬浮适应后也可以长期悬浮培养 三 半贴壁生长细胞 细胞一部分贴壁 但不牢固冲洗摇动即可脱壁 一部分呈悬浮状态生长 无需消化传代 三培养细胞的生长特点和生长增殖过程 一 细胞的生长特点 1 贴附并伸展 呈现各种细胞形态 细胞的贴附和伸展受一些因素的影响 如缺少附着因子 生长因子 离子作用 温度 培养液的流动过快等 特别是小牛血清和钙 镁离子对细胞贴壁影响更为明显 2 密度依赖性 正常细胞有接触抑制过密 换液 传代过稀 PH变碱 生长抑制或死亡 二 细胞的生长增殖过程 1 单个细胞的细胞周期 1 间期 G1 S G2 2 M期 前 中 后 末 细胞周期可划分为四个阶段 图前期两个中心体向两极移动 图片来自http www wadsworth org 图左 前中期 右 中期 图片来自http www wadsworth org 图13 5中期 右图显示与染色体联接的微管 图片来自http www wadsworth org 图后期姊妹染色单体分离 图片来自http www wadsworth org 图13 7后其A染色体分离 后期B两极延伸 2 细胞系的生长过程 正常细胞体外培养有寿命期限 大致分三个阶段 如图1 1 1 原代培养 primaryculture 期亦称初代培养期 为新鲜组织自体内取出接种培养至第一次传代的阶段 一般持续1 4周 特点 原代细胞培养通常为异质性 细胞独立生存性差 多呈二倍体核型 更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性 是检测药物的很好实验工具 2 传代期在细胞整个生命期中此期的持续时间最长 一般为30 50代 能维持二倍体核型 特性稳定 一般原代 5代 10代冻存 3 衰退期此期细胞虽仍存活 但增殖基本停止 细胞形态轮廓增强 进而细胞发生衰退 死亡 细胞在第二期末或第三期初阶段 通过所谓 危机期 crisis 获得不死性而具有持久或无限增殖的能力 失去接触抑制 3 培养细胞传代的生存期 1 滞留期 latentphase 2 指数生长期 logarithmicgrowthphase 又称对数期 试验用 3 平台期又称生长停滞期 stagnatephase 传代 4 细胞系 株及期命名 1 原代细胞 由新鲜组织制成的细胞培养物称 2 次代培养 用胰酶等将原代细胞消化分散后 再培养一代 此操作过程叫传代 3 第1次传代后若能连续传代 10 20代或半年以上 可成为传代细胞系 line 一般细胞系 细胞系只传代 而无实验指标者 限定性细胞系 细胞系一旦作出了一些实验指标者为限定性细胞系 限定性二倍体细胞系 无实验指标属一般二倍体细胞系 若有实验指标 并保持原有的二倍体染色体特性 属限定性二倍体细胞系 细胞株 细胞系的命名 以组织来源定名 如BH