超氧化物歧化酶SOD的生产

项目二：超氧化物歧化酶（SOD）的生产,一. SOD的概况,1.超氧化物歧化酶（SOD）的概念： 超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶，是生物体内抗氧化酶系中主要成员之一。,2.SOD的分类 按其结合的金属离子（即金属辅基的成分）可分为：（1）Fe-SOD（2）Mn-SOD（是SOD酶分子内所含金属离子Mn2+）（3）Cu-Zn-SOD（铜锌超氧化物）,3.SOD的理化性质,3.1 SOD对氰化物和H2O2的敏感性：长时间用过氧化氢处理可使CuZn-SOD和Fe-SOD失活，而Mn-SOD不受影响3.2 SOD的吸收光谱特性：CuZn-SOD具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和酪氨酸的含量较低，它在280 nm处并没有最大吸收峰。CuZn-SOD的可见光最大吸收波长都在680 nm左右， 这反映了酶分子中Cu2+的光学特性。,3.3 SOD稳定性及影响因素：（1）PH、热、蛋白酶的影响：SOD在pH5.39.6间催化性能良好，在pH4.5pH11间能稳定存在。pH3.6时， CuZn-SOD中95%的Zn要脱落，在pH12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变而使酶失活。 （2）SOD对热的稳定性与溶液中离子强度有关。当离子强度很低时,即使加热到95, 其活性损失也很少其他因素：SOD活性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中性、无乙醇饮料中SOD活性较稳定。另外还发现有机溶剂和Cl对SOD的活性具抑制作用。,4.SOD的作用,它催化超氧阴离子转化为H2O2和O2的反应， 即催化超氧阴离子自由基O2-发生歧化反应， 从而清除O2-，2O2-+2H+H2O2+O2， 在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用， 在免疫系统中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，防衰老。 SOD的主要功能是：清除体内多余的自由基，延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象，提高人体抵抗自由基诱发疾病的能力，能抗疲劳、甚至抗肿瘤。,二 SOD的运用,1.药物SOD是一种新型的抗炎症药， 根据SOD作用机制和毒性试验 ，它对治疗因O2-引起的各种 疾病都有一定的疗效。为此， SOD可作为抗衰老、抗炎症、自身免疫疾病患者广泛应用的医药品。此外，SOD对治疗贝切特氏症、心肌梗塞等血虚性心脏病、胶原病、新生儿呼吸困难综合症、防御放射性伤害等也可望有效。,2.添加剂 国外不少高级化妆品都添加SOD， 国内也有数家工厂或公司在开发和生产SOD化妆品， 如大宝SOD密，康妮SOD、SOD康舒达霜剂等。SOD作为化妆品添加剂主要有3个优点：（1）有明显的防晒效果（2）可防皮肤衰老，阻止紫褐质（老年斑）的形成（3）有明显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定效果。国外把SOD作为食品添加剂的例子是加在口香糖和饮料中。我国贵州农学院已开发出刺梨SOD饮料。SOD及修饰过的SOD还可作为外用药膏、眼药及牙膏等的添加剂 。,3. 生化试剂国外已有数家公司如Sigma公司等出售SOD试剂，国内也有厂家批量生产SOD试剂， 如中科院上海生化所东风试剂厂、南京建成生物工程研究所等。此外，SOD有可能作为某些疾病的探针， 如郭彦等人认为脑瘤组织线粒体Mn-SOD降低是转化细胞的可靠生化指标之一， 并可作为评估脑瘤分化程度的参考。,随着人们对SOD更广泛深入的研究，不同类型SOD、SOD修饰物及人工有机合成SOD模拟酶将在医疗、保健、食品、农业增产等方面发挥出更大的作用。,三.SOD的生产,仪器、试剂和材料：-研钵，石英砂，烧杯（50mL），玻璃棒，pH计，冷冻离心机，离心管-新鲜蒜瓣-0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.8），氯仿-乙醇混合液（氯仿-无水乙醇3：5），丙酮（用前预冷至-10）。,提取SOD酶,去除杂蛋白,SOD酶的沉淀分离,离心纯化,超滤浓缩,测定蛋白含量,冷冻干燥后得成品,生产流程：,操作步骤：整个操作过程在0到5条件下进行。,（1）SOD酶的提取 称取5g大蒜蒜瓣，加入石英研磨破碎细胞后，加入0.05mol/L的磷酸缓冲液（Ph7.8）15ml，继续研磨20min，使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后6000r/min冷冻离心15min，弃沉淀，取上清液。,（2）去除杂蛋白 上清液中加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，6000r/min离心15min，弃去沉淀，得到的上清液即为粗酶液。（3）SOD酶的沉淀分离 粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000/min离心15min，得到SOD酶沉淀。,（4）将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液5mL中，然后6000r/min离心15min，放弃沉淀，取上清液，用凝胶sephacylS-200进行纯化，然后超滤浓缩。（5）用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量（6）将浓缩冷冻干燥后即得成品。,四、SOD酶的检验,原理： 连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出氧气，生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间产物的积累在滞后3045s后就与时间成线性关系。中间产物在420nm处有强烈的光吸收，在有SOD存在时由于它能催化生成氧气与过氧化氢，从而阻止了中间物的积累，通过计算就可以求出SOD的活力。,所需溶液的配制：,（1）pH值为8.30的50mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液：25下96.5mL 1mol/L的LK2HPO4与3.5mL 1mol/L的KH2PO4混合后，用水稀释至2000mL。（2）0.05mol/L连苯三酚溶液：称取3.15g连苯三酚用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至500mL。,2、酶活性的测定：（1）连苯三酚自氧化速率的测定在10ml试管中加入pH值为8.30的50mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液4.50ml，在250.5的恒温水浴中保温10min，然后加入在250.5的恒温水浴中事先预热好的连苯三酚溶液（空白管用10mmol/L HCL代替），迅速摇匀倒入1cm比色皿中，以空白管为参比，在325nm下，每隔30s测1次吸光值，连续记录3min，调节连苯三酚溶液用量，将其自氧化速率控制在0.070（0.002）D/min。经实验测得连苯三酚溶液的用量为61。,（2）样品活性测定 在10ml试管中加入pH为8.30的4.5ml50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液和一定体积的样液，在250.5的恒温水浴中保温10min，然后加入在250.5的恒温水浴中事先预热好的连苯三酚61， （空白管用 10mmol/L HCL代替），迅速摇匀倒入1cm比色皿中，以空白管为参比，在325nm下，每隔30s测1次吸光值，连续记录3min，调节样液体积，使样液中连苯三酚的氧化速度控制在0.035（0.002）D/min，记录此时样液体积。,五.SOD使用及生产时的注意事项,1.SOD的安全性大量试验和临床应用表明， 无论何种给药方式，除罕见的超敏反应外，SOD对人体无毒性。虽然SOD是Mr在30 000以上的蛋白质， 但却未发现具有抗原性， 其原因也正在进一步研究中。2.SOD生产时的注意事项（1）在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底（2）PH的控制力度很重要，以及在实验中的温度等（3） 要学会正确使用分光光度计,紫外分光光度法测定蛋白质含量,本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。