课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

土壤中分解尿素细菌的分离与计数知识清单土壤中分解尿素细菌的分离与计数知识清单 一 研究思路 1 筛选菌株 1 实验室中微生物筛选的原理 人为提供有利于 生长的条件 包括营养 温度 pH 等 同时 或 其他微生物生长 2 选择培养基 在微生物学中 将允许 种类的微生物生长 同时 或 其他 种类微生物生长的培养基 称做选择培养基 3 分离分解尿素的细菌的选择培养基 在该培养基配方中 为微生物的生长提供碳源的是 提供氮源的是 琼脂的作用是凝固剂 该培养基对微生物具有选择作用 其选择机制是 才能在该培养基上生长 土壤中的细菌之所以能分解尿素 是因为它们体内能合成 将尿素分解的 反应式是 Taq细菌能忍受 93 左右的高温 是在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的 这说 明 在寻找目的菌株时 要根据 2 统计菌落数目的方法 1 稀释涂布平板法 也叫活菌计数法 原理 当样品的稀释度足够高时 培养基表面生长的一个菌落 来源于样品稀释液 中的 通过统计平板上的 就能推测出样品中大约含有多少活菌 操作 第一 设置重复组 增强实验的说服力与准确性 将待测样品经一系列 10 倍稀释 然 后选择 稀释度的菌液 分别取 0 1 mL 接种到已制备好的平板上 然后用无菌涂布 器将菌液涂布整个平板表面 放在适宜的温度下培养并计算菌落数 为使结果接近真实值 可将同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板上 培养并计算出 第二 为了保证结果准确 一般选择菌落数在 的平板进行计数 若设置的重 复组中结果相差太远 意味着操作有误 需重新实验 计算公式 每克样品中的菌株数 M 其中 C 代表 C V V 代表 mL M 代表 2 显微镜直接计数法 原理 此法利用特定的 或 在显微镜下计算一定容积 的样品中微生物的数量 但不能区分细菌的死活 计数板是一块特制的载玻片 上面有一 个特定的面积 1 mm2和高 0 1 mm 的计数室 在 1 mm2的面积里又被划分成 25 个 或 16 个 中格 每个中格进一步划分成 16 个 或 25 个 小格 计数室由 个小格组成 操作 将稀释的样品滴在计数板上 盖上盖玻片 然后在显微镜下计数 4 5 个中格 中的细菌数 并求出每个小格所含细菌的平均数 再按公式求出每毫升样品中所含的细菌 数 计数公式 每毫升原液所含细菌数 每小格平均细菌数 400 10 000 稀释倍数 3 设置重复和对照 设置重复 培养过程中应设置重复组 同一稀释度下应涂布 个平板 才能 增强实验的说服力与准确性 设置对照 实验中应设置对照 主要目的是 对实验结果 的影响 提高实验结果的可信度 如 对照组 观察培养物中是否有杂菌污染 设置 培养基 观察选择培养基是否具有 作用 二 实验设计 实验步骤 1 土壤取样 从肥沃 湿润的土壤中 用无菌小铁铲铲去表层土 3 cm 左右 迅速取 土壤并装入 密封或事先准备好的 中 2 制备培养基 制备 培养基作为对照组 尿素为唯一氮源的培养 基作为 用来判断选择培养基是否具有 放宽稀释范围 如稀释倍数为 103 107范围内的要分别涂布 而每个稀释度下需要 个选择培养基 个牛肉膏蛋白胨培养基 因此需要 15 个选择培养基和 5 个 牛肉膏蛋白胨培养基 两种培养基应各有一个作为 对照 此外还需准备 8 个灭菌的试管和 1 个灭 菌的移液管 3 样品的稀释与涂布平板 参考下面的实验流程示意图 将 10 g 土样加入盛有 90 mL 无菌生理盐水的锥形瓶中 锥形瓶体积为 250 mL 充分摇匀 吸取上清液 1 mL 转移 至盛有 mL 生理盐水的无菌大试管依次等比稀释至 107稀释度 并按照由 107 103稀释度的顺序分别吸取 mL 进行平板涂布操作 按照浓度从低到高的顺序涂 布平板 不必更换移液管 说明 图中的 1 2 3 平板是 4 为 作对照 判 断选择培养基是否具筛选作用 还有两个空白对照 即不涂布稀释后菌液的选择培养基和 牛肉膏蛋白胨培养基 验证培养基中是否 4 将涂布好的培养皿放在 30 温度下培养 及时观察和记录 5 挑选选择培养基上不同形态的菌落接入含 培养基的斜面中 观察能否 产生颜色反应 6 细菌的计数 当菌落数目稳定时 选取菌落数在 的平板进行计数 在同一稀释度下 至少 对 3 个平板进行重复计数 然后求出 并根据平板所对应的稀释度计算出样 品中细菌的数目 同时仔细观察所分离到的菌落 并记录菌落特征 7 统计表格 表一 平板上的菌落数记录表 稀释倍数 103104105106107 12341234123412341234 1 2 3 表二 菌落特征记录表 菌落 种类 形状大小 隆起 程度 颜色 1 2 3 注 一般来说 在一定的培养条件下 相同的培养基 温度及培养时间 表现出 的菌落特征 三 操作提示 1 取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要 2 应在 旁称取土壤 在火焰附近将称好的土样倒入 中 塞好棉塞 3 在稀释土壤溶液的过程中 每一步都要在 旁操作 4 实验时要对 做好标记 注明 等 5 为了提高效率 在操作时更加有条不紊 应当 四 结果分析与评价 内容结论分析 有无杂菌污染的 判断 对照的培养皿中 菌落生长 未被杂菌污染 培养物中菌落数 被杂菌污染 菌落形态多样 菌落数偏高 培养物中混入 选择培养基的筛 选作用 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目 选择培养基的数目 选择培养基具 筛选作用 已筛选出一些菌落 样品的稀释操作 得到 2 个或 2 个以上菌落数目在 的平板 操作成功 能进行菌落的 计数 重复组的结果 若选取同一种土样 统计结果应 如果结果相差太远 说明实验操 作过程中出现操作失误 需要找出产生差异的原因 五 课题延伸 在细菌分解尿素的化学反应中 细菌合成的 将尿素分解成了 氨会 使培养基的碱性增强 升高 因此 我们可以通过检测培养基 来判 断该化学反应是否发生 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 指示剂 培养某种细菌后 如果 pH 升高 指示剂将 这样 我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素 土壤中分解尿素细菌的分离与计数土壤中分解尿素细菌的分离与计数 知识清单知识清单 一 一 1 1 1 1 目的菌株目的菌株 抑制抑制 阻止阻止 2 2 特定特定 抑制抑制 阻止阻止 3 3 葡萄糖葡萄糖 尿素尿素 只有能够以尿素作为氮源的微生物只有能够以尿素作为氮源的微生物 脲酶脲酶 CO NHCO NH2 2 2 2 H H2 2O OCOCO2 2 2NH2NH3 3 它对生存环境的要求 到相应的环境中去寻找它对生存环境的要求 到相应的环境中去寻找 脲脲酶酶 2 2 1 1 一个活菌一个活菌 菌落数菌落数 三个三个 菌落平均数菌落平均数 3030 300300 某一稀释度下平板上生某一稀释度下平板上生 长的平均菌落数长的平均菌落数 涂布平板时所用的稀释液的体积涂布平板时所用的稀释液的体积 稀释倍数稀释倍数 2 2 细菌计数板细菌计数板 血细胞血细胞 计数板计数板 400400 3 3 至少至少 3 3 排除实验组中非测试因素排除实验组中非测试因素 空白空白 完全完全 筛选筛选 二 二 1 1 1 1 无菌信封无菌信封 烧杯烧杯 2 2 牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨 实验组实验组 选择作用选择作用 3 3 1 1 空白空白 3 9 3 9 0 10 1 选择培养基选择培养基 牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 含有杂菌含有杂菌 5 5 酚红指示剂酚红指示剂 6 30 6 30 300300 平均值平均值 7 7 同种微同种微 生物生物 稳定稳定 三 三 1 1 灭菌灭菌 2 2 火焰