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文档简介

酵母RNA的提取与鉴定 实验目的 掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程 了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法 实验原理 由于RNA的来源和种类很多 因而提取制备方法也各异 一般有苯酚法 去污剂法和盐酸胍法 苯酚法是实验室最常用的 组织匀浆用苯酚处理并离心后 RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中 DNA和蛋白质则留在苯酚层中 向水层加入乙醇后 RNA即以白色絮状沉淀析出 此法能较好地除去DNA和蛋白质 提取的RNA具有生物活性 实验原理 酵母细胞富含核酸 且核酸主要是RNA 含量为干菌体的2 67 10 0 而DNA含量较少 仅为0 03 0 516 为此提取RNA多以酵母为原料 工业上制备RNA多选用低成本 适于大规模操作的稀碱法或浓盐法 这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA 主要用作制备单核苷酸的原料 其工艺比较简单 稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性 裂解 然后用酸中和 除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2 5利用等电点沉淀 提取的RNA有不同程度的降解 浓盐法是用高浓度盐溶液处理 同时加热 以改变细胞壁的通透性 使核酸从细胞内释放出来 实验原理 RNA含有核糖 嘌呤碱 嘧啶碱和磷酸各组分 RNA在酸性条件下 即发生降解 形成的核糖继而转变为糠醛 后者与地衣酚 3 5 二羟基甲苯 反应呈鲜绿色 该反应需用三氯化铁或氧化铜作催化剂 本实验采用的稀碱 既可加速细胞的破裂 又可增大RNA的溶解度 当碱被中和后 可用乙醇将RNA沉淀 此为RNA的粗品 样品中少量脱氧核糖核酸 DNA 存在对鉴定无干扰 蛋白质 粘多糖可干扰鉴定 试剂的配制 地衣酚 苔黑酚 三氯化铁试剂将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中 再加入100mgFeCl3 6H2O 或等量CuO 此液需临用时配制 实验步骤 1 酵母RNA的提取称5g干酵母粉于150ml三角烧瓶中 加50ml0 2 的NaOH 沸水浴中搅拌提取30min 冷却后滴加乙酸使其略偏酸性 pH5 6 离心 4000r min 15min 去除沉淀 向上清液中加入30ml95 乙醇 稍搅拌后静置 待完全沉淀后离心 4000r min 15min 去上清液 沉淀加10ml95 乙醇 搅拌后再次离心 沉淀再依次用10ml的无水乙醇 乙醚 2 洗涤 得RNA粗品 2 RNA的鉴定取沉淀约0 2g 加2ml10 H2SO4 沸水浴中加热2min 加1 5ml地衣酚试剂 沸水浴中加热 观察颜色变化 实验步骤 注意事项 稀碱法提取的RNA为变性RNA 可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备 不能作为RNA生物活性实验材料 利用等电点控制RNA析出时 应严格控制pH 地衣酚反应特异性较差 凡戊糖均有此
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