光合细菌分离方法的优化研究

光合细菌分离方法的优化研究 摘要 以污水处理厂污泥中光合细菌为材料 对其进行了分离方法的优化 采用半固体试管 法 双层平板涂布法 平板稀释分离法 Hungate 滚管法 双层平板划线法对光合细菌进行 了分离试验研究 比较各分离方法的优缺点 关键词 光合细菌 分离方法 厌氧 优化 光合细菌 Photosynthetic bacteria PSB 广泛分布于淡 水 海水 极地或温泉 包括高热水体 以及高盐 高有机 质含量等不同的生态环境中 是一类进行不产氧光合作 用 具有复杂代谢功能的微生物 它能利用多种基质 可 以异养 自养或兼性营养 存在着好氧 厌氧和兼性厌氧 类型 1 具有较强的分解有机物特性 作为净化剂和饲料 广泛应用于水产养殖和畜禽养殖 2 5 光合细菌属于水圈微生物中的一类 大部分 PSB 是 从土壤 水沟和污泥中分离得到 由于 PSB 在厌氧条件 下更易生长 且分离技术要求高 很难富集并分离到活性 高的光合细菌 对光合细菌的多种分离方法进行比较 分析不同分离方法的效果 1 实验材料和方法 1 1 样品来源 光合细菌采自污水处理厂污泥 经富集培养 分离纯 化 获得红假单胞菌属的光合细菌 1 2 培养基 富 集 培 养 基 CH 3 COONa 3 0 g CH 3 CH 2 COONa 0 3 g NaCl 1 g NH 4 2 SO 4 0 3 g MnSO 4 25 mg K 2 HPO 4 0 3 g KH 2 PO 4 0 5 g CaCl 2 0 05 g MgSO 4 7H 2 O 0 2 g FeSO 4 7H 2 O 0 005 g 酵母膏 0 1 g 蛋白胨 0 01 g 蒸馏 水 1 000 ml pH 7 0 6 分 离 培 养 基 CH 3 COONa 3 0 g CH 3 CH 2 COONa 0 3 g NaCl 0 5 g NH 4 Cl 1 g MgSO 4 7H 2 O 0 2 g K 2 HPO 4 0 3 g KH 2 PO 4 0 5 g CaCl 2 0 05g MnCl 2 4H 2 O 0 003 g FeSO 4 7H 2 O 0 005 g 酵母膏 0 1 g 蛋白胨 0 01 g 谷氨酸 0 0002 g 蒸馏水 1 000 ml 琼脂 20 g pH 7 2 7 4 121 高压灭菌 30 min R 培养基 CH 3 COONa 3 0 g NaHCO 3 1 0 g NH 4 Cl 1 0 g K 2 HPO 4 0 5 g MgCl 2 0 2 g FeCl 2 EDTA 0 005 g NaCl 5 0 g 抗氧化剂 0 25 g 琼脂粉 8 g 蒸馏水 1 000 ml pH 7 4 0 2 121 灭菌 15 min 1 3 制备样品稀释度 以无菌操作取 25 ml 样品 放入装有 225 ml 无菌水的 灭菌三角瓶内 混匀 用 10 ml 的灭菌移液管准确吸取 10 ml 的样品匀液放入装有 90 ml 稀释剂的三角瓶 混匀 制成 1 100 的样品液 依此类推 将菌液稀释至 10 6 10 7 10 8 7 1 4 分离方法 1 4 1 半固体试管法 取光合细菌不同稀释度 0 5 ml 或 1 ml 于试管 迅速 倒入灭菌后的 R 培养基 20 ml 温度为 50 左右 待凝 固后上层覆盖 5 ml 1 灭菌纯琼脂 同时用稀释剂做空 白对照 于光照培养箱培养 8 1 4 2 双层平板涂布法 取光合细菌不同稀释度 0 5 ml 和 1 ml 菌液 在已经 置备好无冷凝水的装有分离培养基平板上均匀涂布 同 时上层覆盖分离培养基保持厌氧 室温放置 1 h 用封口 膜封口 30 1 500 2 000 lx 光照强度下厌氧培养 9 1 4 3 平板稀释分离法 取光合细菌不同稀释度 0 5 ml 和 1 ml 菌液与已熔化 并冷却至 50 左右的琼脂培养基混合 摇匀后 倾人灭过 菌的培养皿中 待琼脂凝固后 制成可能含菌的琼脂平 收稿日期 2011 03 07 基金项目 辽宁省科技攻关项目 2005229003 辽宁省科技厅项目 20060117 232 辽 宁大学 211 三期重点学科资助项目 作者简介 徐成斌 1980 男 汉族 辽宁省大连市人 讲师 主要从事环境微生物学 研究 E mail xuchengbin80 163 com 通讯作者 马溪平 1957 女 汉族 辽宁省沈阳市人 教授 主要从事环境工程微生 物学研究 辽 宁 农 业 科 学 2011 年 板 同时上层覆盖一层分离培养基保持厌氧 保温培养一 定时间即可出现菌落 用接种环将不同特征的单个菌落 挑出 接种到相应的液体培养基中培养 7 1 4 4 Hungate 滚管法 10 固体培养基的滚管技术是指将装有热熔培养基的厌 氧管放入装有冷水的平底盆中迅速不断转动而制成 当 琼脂围绕管壁完全凝固后 琼脂滚管即可垂直放置贮存 并可使少量未凝结的水分集中在底部 用注射器将不同 稀释度的菌液射入已滚好的厌氧管中培养 灭菌厌氧管 接种时 橡皮塞在火焰上灼烧 稍冷后通过橡皮塞注入菌 液 30 1 500 2 000 lx 光照强度下厌氧培养 待出现 单菌落 接种到相应的液体培养基中培养 1 4 5 双层平板划线法 用灼烧后的接种环挑取一环细菌悬液 在已经制备 好的装有分离培养基的平板上划线 之后用 15 20 ml 融 化后冷却至 50 左右的培养基覆盖上层 静置待其凝 固 30 1 500 2 000 lx 光照强度下厌氧培养 7 2 结果与分析 2 1 深层试管法 采用深层试管法见图 1 所示 在稀释度为 10 2 10 3 10 4 10 5 时 细菌菌落密集 稀释度在 10 6 10 8 时 较易形成单个菌落 采用破管法挑取菌落 但此方法 重复性不好 且由于培养基呈圆柱状 故为挑单个菌落造 成困难 图 1 深层试管法数码照片 2 2 双层平板涂布法与平板稀释分离法 采用双层平板涂布法与平板稀释分离法 在稀释度 10 2 10 4 时 细菌菌落密集 稀释度在 10 5 10 7 时 单 菌落出现 但菌落特征不明显 这种分离技术适合于好 氧菌或兼性菌的分离 11 应用到严格厌氧细菌的分离 分 离效果相对较差 且使用双层平板涂布法不易形成单菌 落 2 3 Hungate 滚管法 Hungate 滚管技术已广泛的应用到厌氧微生物的分 离上 本实验针对李永峰 12 改进的 Hungate 滚管技术进 行调整 先将熔菌液化的固体培养基 4 ml 注入厌氧管中 在冷水中迅速的滚动 待固体培养基均匀的布满管壁 冷 却 静止备用 这可避免温度控制不当 培养基未注入菌 液之前先凝固 从而避免培养基过高 导致注入的菌体死 亡 Hungate 滚管技术 如图 2 所示所用滚管透明度差 长出的菌落又面向管内生长 难以看清菌落的形态特征 给菌落的挑取造成一定的困难 13 图 2 Hungate 滚管法数码照片 2 4 双层平板划线法 采用平板划线法见图 3 所示 观察菌落特征直观 菌 落特征明显 采用灼烧的接种环透过上面一层培养基挑 取位于中间层的单菌落 这种分离方法较其他方法更易 形成单菌落 且菌落挑取方法简单 图 3 双层平板划线法数码照片 10 第 3 期 徐成斌等 光合细菌分离方法的优化研究 2 5 多种分离方法的比较 表 1 光合细菌分离方法的比较 方法 深层试管法 双层平板涂布法 稀释倒平板法 Hungate 滚管法 双层平板划线法 优点 较易形成单菌落 保 持厌氧 保持厌氧 挑菌方法 容易 易于观察菌落 的形态 分离速度快 方法简便 挑菌方法 容易 易于观察菌落 的形态 更利于好氧 菌的生长 利于均匀冷却 菌落 更易生长 且菌落生 长速度快 保持厌氧 易于观察菌落的形 态 更容易出现单菌 落以及易于单菌落的 挑取 缺点 重复性差 挑菌落难 度系数高 不易形成单菌落 不易形成单菌落 且 菌落易成片生长 透明度差 菌落挑取 困难 操作较复杂 3 结论 光合细菌在厌氧条件下更易生长 为了快速 准确 的分离得到光合细菌菌株 营造厌氧的条件必不可少 通过上述试验得出如下结论 3 1 使用深层试管法 Hungate 滚管法和双层平板画线 法均能保持厌氧的条件 深层试管法和 Hungate 滚管法 分离 挑菌难度系数高 双层平板涂布法和稀释平板法不 易形成单菌落 平板划线法易形成单菌落且单菌落更易 挑取 但菌落分散效果不好 3 2 接种量是分离纯化光合细菌的重要环节 接种量大 稀释倍数低产生的菌落密集 很难挑取单菌落 稀释倍数 10 6 10 8 为最佳 培养后有单菌落生成 易于分离 3 2 接种量确定后 双层平板化线法是一种快速可行的 菌种分离方法 参考文献 1 Holt J G Krieg N R Bergey S Manual of Systematic Bacteriolo gy 9thed M Baltimore London Williams Wilkins Co 1994 353 376 2 沈镇昭 作物栽培学各论 M 北京 中国农业出版社 1994 332 333 3 张宪政 作物生理研究法 M 北京 农业出版社 1992 129 130 4 李合生 植物生理生化实验原理和技术 M 北京 高等教 育出版社 2000 195 197 5 刘金伟 沙伟 王艳军 低温胁迫对不同物候期细叶杜香的 生理影响 J 植物研究 2004 24 2 197 200 6 杨晨敏 谷军 哈尔滨市污染水质中光合细菌的分离 鉴定 及发酵条件研究 J 哈尔滨师范大学自然科学学报 1999 15 6 95 98 7 马放 任南琪 杨基先 污染控制微生物学实验 M 哈尔 滨 哈尔滨工业大学出版社 2002 49 50 8 刘军义 汪文龙 李娟 光合细菌的计数方法 半固体试 管法 J 中国水产 2003 11 68 69 9 孙军德 赵春燕 李炳学 等 光合细菌双层平板计数方法的 研究 J 沈阳农业大学学报 2001 32 2 110 112 10 Hungate R E A Roll Tube Method for Cultination of Strict Anaerobes M 北京 高等教育出版社 1969 23 11 穆军 张肇铭 一种分离纯化厌氧细菌的新方法 平皿 夹层厌氧法 J 山西大学学报 1998 21 4 363 367 12 李永峰 任南琪 李建政 等 发酵产氢细菌分离培养的厌 氧实验操作技术 J 哈尔滨工业大学学报 2004 12 50 54 13 Ueno Y Otsuka S Mormoto M Hydrogen production from in dustrial wastewater by anaerobic microflora in chemostatculture J Ferment 2002 The Research on Separation Optimization of Photosynthetic Bacteria XU Cheng bin 1 MENG Xue lian 2 MA Xi ping 1 ZHANG Li hong 1 1 Environmental Science Institute of Liaoning University Shenyang Liaoning 110036 2 Pharmacy Institute of Liaoning Uni versity Shenyang Liaoning 110036 Abstract Photosynthetic bacteria in the sewage sludge as the material we study method of the separation op timizing We research semi solid tube method double plate coating metho