细胞冻存与细胞复苏标准操作规程(SOP)

背景知识背景知识 细胞培养的传代及日常维持过程中 在培养器具 培养液及各种准备工作方面都需大量的 耗费 而且细胞一旦离开活体开始原代培养 它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着 传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化 因此及时进行细胞冻存十分必 要 细胞冷冻储存在 70 冰箱中可以保存一年之久 细胞储存在液氮中 温度达 196 理论上储存时间是无限的 原理原理 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融 实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力 目 前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂 这两种物质能提高细胞膜对水的通透性 加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外 减少细胞内冰晶的形成 从而减少由于冰晶 形成造成的细胞损伤 复苏细胞应采用快速融化的方法 这样可以保证细胞外结晶在很短 的时间内即融化 避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤 主体内容 操作步骤 主体内容 操作步骤 一 材料一 材料 一 仪器 1 净化工作台 2 离心机 3 恒温水浴箱 4 冰箱 4 20 70 5 倒置相差显微镜 6 培养箱 7 液氮冰箱 易生物仪器库 二 玻璃器皿 1 吸管 弯头 直头 2 培养瓶 3 玻璃瓶 250ml 100ml 4 废液缸 三 塑料器皿 1 吸头 2 枪头 3 胶塞 4 移液管 10ml 5 15ml 离心管 6 冻存管 1 2ml 四 其他物品 1 微量加样枪 2 红血球计数板 3 记号笔 4 医用橡皮膏 5 移液枪 五 试剂 1 D Hanks 液 2 小牛血清 3 培养液 4 双抗 青霉素 链霉素 5 胰蛋白酶 0 08 6 1NHCl 7 7 4 NaHCO3 8 DMSO 分析纯 或无色新鲜甘油 易生物试剂库 二 操作步骤二 操作步骤 一 细胞冻存 1 配制含 10 DMSO 或甘油 10 20 小牛血清的冻存培养液 2 取对数生长期的细胞 用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来 悬浮生长的细胞 则直接将细胞移至 15ml 离心管中 3 离心 1000rpm 5min 4 去除胰蛋白酶及旧的培养液 加入适量配制好的冻存培养液 用吸管轻轻吹打使 细胞均匀 计数 调节冻存液中细胞的最终密度为 5 106 ml 1 107 ml 5 将细胞分装入冻存管中 每管 1 1 5 ml 6 在冻存管上标明细胞的名称 冻存时间及操作者 7 冻存 标准的冻存程序为降温速率 1 2 min 当温度达 25 以下时 可增至 5 10 min 到 100 时 则可迅速浸入液氮中 也可将装有细胞的冻存管放入 20 冰箱 2h 然后放入 70 冰箱中过夜 取出冻存管 移入液氮容器内 二 细胞复苏 1 从液氮容器中取出冻存管 直接浸入 37 温水中 并不时摇动令其尽快融化 2 从 37 水浴中取出冻存管 打开盖子 用吸管吸出细胞悬液 加到离心管并滴加 10 倍以上培养液 混匀 3 离心 1000rpm 5min 4 弃去上清液 加入含 10 小牛血清培养液重悬细胞 计数 调整细胞密度 接种 培养瓶 37 培养箱静置培养 5 次日更换一次培养液 继续培养 三 注意事项三 注意事项 1 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存 但最好为对数生长 期细胞 在冻存前一天最好换一次培养液 2 将冻存管放入液氮容器或从中取出时 要做好防护工作 以免冻伤 3 冻存和复苏最好用新配制的培养液 四 细胞复苏四 细胞复苏 在细胞复苏过程中 有多次复苏失败 最终在查阅了相关技术积累了足够的复苏技能后复 苏成功 现将细胞复苏的操作程序和注意事项总结如下 望能为同行提供些参考 材料材料 1 常规细胞培养仪器设备 恒温水浴振荡器 2 培养液 DMEM 胎牛血清 CBS 二甲基亚砜 DMSO 操作程序操作程序 1 细胞实验室进行常规消毒 紫外照射 40min 以上 2 培养液 DMEM 0 25 胰蛋白酶 Trypsin 恒温水浴箱 370C 预热 20min 备用 3 二甲基亚砜 DMSO 在 4 度冰箱中冷藏 30min 备用 4 从液氮保存罐中取出冻存管 立即放入 40 度水浴中 快速摇晃 直至冻存液完全融化 5 将细胞悬液移入 15ml 离心管 缓慢加入 4ml 培养液 离心 1000r min 5min 6 用培养液悬液混悬沉淀细胞 调整细胞浓度 放培养箱中培养 7 记录复苏日期 注意事项注意事项 1 取细胞的过程中注意带好防冻手套 护目镜 此项尤为重要 细胞冻存管可能漏入液 氮 解冻时冻存管中的气温急剧上升 可导致爆炸 2 冻存液的问题 冻存液的配置已是常识 在这里不作详述 但二甲基亚砜 DMSO 对细胞不是完全无毒副作用 在常温下 二甲基亚砜对细胞的毒副作较大 因此 必须在 1 2min 内使冻存液完全融化 如果复苏温度太慢 会造成细胞的损伤 二甲基亚砜 DMSO 最好选择进口产品 3 离心前须加入少量培养液 细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高 注意加入少量培养液可 稀释其浓度 以减少对细胞的损伤 4 离心问题 目前主要有两种见解 一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培 养瓶中进行培养 第二天换液 因为离心的目的是两个 去除 DMSO 去除死细胞 这个 是标准流程 但对一般人来说 把握不好离心转速和时间 转的不够活细胞沉底的少 细 胞就全被扔掉了 转过了活细胞会受压过大 死亡 此外在操作过程中容易污染 所以不 推荐 另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜 DMSO DMSO 对细胞有一定的毒副作 用 所以须将离心后的液体前倒净 且一定倒干净 我在试验中按照常规的离心分装的方 法进行复苏 结果无异常 5 细胞贴壁少的问题 教科书中说明冻存细胞解冻时 1ml 细胞液要加 10ml 15m 培养液 而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附 6 复苏细胞分装的问题 试验中我的经验总结为复苏 1 管细胞一般可分装到 1 2 只培养 瓶中 分装过多 细胞浓度过低 不利于细胞的贴壁 7 加培养基的量放入问题 这个量的多少的把握主要涉及到的问题是 DMSO 的浓度 从 如果你加培养