免疫标记技术,节酶免疫技术

,免疫学检验,第十六章 酶免疫技术,1.酶联免疫吸附试验的原理、方法类型、 应用及注意事项。2.酶免疫分析技术的分类。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技术的基本原理及应用。,本章要点,目录,前 言,酶免疫分析技术是以酶标记抗原或抗体为主要试剂，检测样本中相应的抗体或抗原。将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物的放大作用和高敏感性相结合的一种免疫检测技术。,第一节 酶标志物的制备,一 、常用的酶和底物,标记酶的条件： 1.活性高，纯度高2.作用专一性强3.性质稳定，易与抗原或抗体偶联4.测定方法简便易行、敏感、精确5.酶和底物对人体无害且价廉易得,1.辣根过氧化物酶（HRP）,糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心,RZ值越大纯度越高,RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要,ELISA中应用最为广泛的标记用酶,常用酶,HRP的底物,DH2+H2O2 D+2H2O,HRP,供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种。,H2O2为受氢体，不稳定，需在用前临时配置。,OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。,TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,HRP的常见底物,2.碱性磷酸酶,是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌中提取 。,ALP 底物,对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。,二、制备酶标记抗体(抗原）的方法,制备酶标记物的方法应符合简单、产量高，避免酶、抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物，标记反应不影响酶的活性和抗原抗体的免疫反应性等原则。,主要方法：戊二醛交联法 改良过碘酸钠法,三、酶标记物的纯化与鉴定,纯化的方法较多，分离大分子混合物的方法均可应用。常用的是凝胶层析法和硫酸铵盐析法，硫酸铵盐析法操作简便。,酶标记物的鉴定主要有：1、酶活性和抗体（抗原）免疫活性的鉴定 2、酶标记率的测定,四、固相载体,（一）固相载体的要求,结合抗体或抗原的容量大；与抗原或抗体结合稳定且不易脱落；不影响所固定的抗体或抗原的活性；固化方法应简便、快速。,（二）固相载体的种类,1塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状 主要有微量反应板、小试管和小珠三种。,2微粒 微颗粒是由高分子单体聚合成的微球 或颗粒。,3. 膜载体 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸 纤维素膜（NC）、玻璃纤维素膜等。,第二节 酶联免疫吸附试验,一、ELISA的检测原理,将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分开。加入酶的底物后，通过酶对底物催化的显色反应程度，对标本中抗原或抗体进行定性或定量。,二、ELISA的方法类型,（一）双抗体夹心法,双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，适用于检测含有至少两个抗原决定簇的较大分子抗原的测定。,如果血清标本中含有类风湿因子（RF），则可出现假阳性反应。因为类风湿因子是一种抗变性IgG的自身抗体，它可同时与固相抗体和酶标抗体的Fc段发生结合，导致假阳性的出现。,（二）双位点一步法,测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。,如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成“钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。,（三）间接法,间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体（亦称为酶标二抗）来检测已与固相结合的待测抗体。,此法由于受血清中高浓度非特异性IgG的干扰，通常要将待测标本进行一定稀释后才能测定。,（四）竞争法,竞争法既可用于检测抗原，也可用于检测抗体 。,待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与待测抗原的量呈反比，待测抗原越多，其结合特异性抗体越多，而酶标抗原与特异性抗体结合就减少，底物显色反应浅；显色越深，待测抗原量则越少。,竞争法测抗原,竞争法主要用于检测小分子抗原，因小分子抗原只有一个抗原决定簇 。,竞争法检测抗体,HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。,1.竞争法检测HBcAb：先将HBcAg包被在固相载体上，形成固相抗原，之后加入待测样本和酶标的特异抗体，待测样本的抗体将与酶标抗体竞争与固相载体上的特异抗原结合，温育后洗涤，加入酶底物显色，显色的强弱与待测抗体的含量成反比 。,竞争法检测HBcAb,2.竞争法检测HBeAb：先将HBeAb包被在固相载体上，形成固相抗体，同时加入待测样本和中和抗原HBeAg，待测样本的抗体将与固相抗体竞争与中和抗原HBeAg结合。加入酶标的特异抗体，再加入酶底物，则显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比。,竞争法检测HBeAb,(五) 捕获法,固相载体上连接的是IgM的第二抗体，先将标本中的IgM类抗体捕获，然后再分别加入特异抗原和酶标抗体（动物源性IgG），形成抗人IgM-IgM-特异抗原-酶标抗体的复合物，复合物含量与待测IgM成正相关。最后加入底物，依据显色程度来确定待测血清中IgM的含量。,捕获法检测lgM抗体,在应用此法时需注意RF(IgM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(IgM类)既能与固相载体上的IgM第二抗体结合，又能与随后加入的酶标抗体结合，从而导致假阳性结果。,(六) 双抗原夹心法,将已知抗原包被在固相载体上，待测标本中的相应抗体可分别与固相抗原和酶标抗原结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原的复合物，加入底物后依据显色程度来确定待测抗体的含量。,三、ELISA的关键技术,（一）各种试剂的制备,1抗原和抗体2包被与封闭 包被(coating)是将抗原或抗体固定在固相载体上的过程。封闭(blocking)就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。 3酶标结合物的制备,（二）最适工作浓度的选择,间接法测抗体中包被抗原最适工作浓度的选择,（三）测定方法的标准化,1加样 应力求准确，并注意不可产生气泡。2温育 注意反应的温度和时间应按规定的 要求，整块反应板的温度应一致。3洗涤 洗涤有手工洗涤和洗板机洗涤两种方法，若用洗板机洗涤要适当增加洗涤次数。 4显色 要控制好显色时间。,四、评价与应用,评价,ELISA的方法具有高度的特异性和灵敏度，操作方便快速，试剂稳定，对环境无污染，仪器、设备要求简单，实验结果既可以用肉眼观察作定性分析，也可以用酶标仪进行定性、定量分析，已经成为临床免疫检验中的常用技术。,应用,1.病原微生物测定2.激素测定3.药物测定4.肿瘤标志物5.蛋白质测定,第三节 其他酶免疫技术,一、均相酶免疫技术,（一）酶扩大免疫分析技术 （二）克隆酶供体免疫分析,酶扩大免疫分析技术示意图,克隆酶供体免疫分析示意图,液相酶免疫技术是非均相酶免疫技术的方法类型之一，因抗原抗体反应在液相中进行而得名。其依据样品抗原加样顺序和温育反应时相不同可分为平衡法和非平衡法两种类型。,二、液相酶免疫技术,三、斑点酶免疫吸附试验,属于ELISA的一种类型，与前述的ELISA有所不同的是用吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜（NC膜）代替了聚苯乙烯反应板来作为固相载体，酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC膜染色。,四、斑点酶免疫渗滤试验,是将NC膜封于塑料小盒中，先在塑料小盒NC膜中滴加已知抗体，干燥后封闭，再依次加入待测标本、酶标抗体，最后加入底物，阳性时可在膜上出现有色斑点。,五、免疫印迹试验,是一种将蛋白质电泳和酶免疫测定相结合的技术，综合了凝胶电泳的