cDNA第二链合成

1 Superscipt II RT 合成第一链合成第一链 1 在一 RNase free 的 0 2ml PCR 管中 加入 xul mRNA 大约 500ng 1ul Xho I Primer 1 4ug ul 5 GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3 11 x ul RNase free water 大于 500ng mRNA 分 n 管 500ng tube 合成第一链 第一链合成完毕后将 n 管合成一管 进行第二链合成 2 混匀后 70 反应 10 分钟 3 反应完成后 立刻将反应体系置于冰上 5min 4 稍微离心一下 顺序加入以下试剂 4ul 5 first strand buffer 2ul 0 1M DTT 1ul 10mM dNTP 自己配制 5 混匀 稍微离心反应物之后 42 放置 2 分钟 6 反应完成 趁热加入 1 ul Superscipt II RT 混匀 7 42 反应 50 分钟 然后 70 15 分钟灭活反转录酶 2 cDNA 第二链的合成第二链的合成 1 第一链反应完成后 取 2ul 一链产物 20 冰箱中保存 待电泳检测 其余的产物合并 混匀 然后顺序加入下列试剂 promega 20ul 10 DNA Polymerase I buffer 6ul 10mM dNTP 自己配制 xul dd H2 O 1ul RNase H 2U ul 10ul DNA Polymerase I 10U ul 总体系为 200ul 2 混匀后 16 反应 2 5 小时 3 70 灭活 10 分钟 4 反应完成后 得到 200ul cDNA 第二链反应体系 将此体系置于冰上 5 取 2ul 二链产物 同保存的一链产物一起电泳鉴定 同时上 1kb ladder 确定双链的大 小范围 注 一链 二链的电泳图是 smear 且二链稍比一链大一些 3 双链双链 cDNA 末端补平末端补平 1 在第二链反应体系中 顺序加入下列试剂 promega 6ul 10mM dNTP 2ul T4 DNA Polymerase 8 7U ul 2ul BSA 10mg ml 2 稍微离心混匀反应物 37 反应至少 30 分钟 然后 75 灭活 10 分钟 3 加入等体积酚 氯仿 异戊醇 剧烈振荡后 常温下 13000g 离心 5 分钟 4 离心后 吸取上清于另一 1 5ml eppendof 管中 加入等体积氯仿 上下颠倒几次混匀后 常 温下 13000g 离心 5 分钟 5 吸取上清至另一 eppendof 管 加入 1 10V3M NaAc PH5 2 和 2 5V 预冷的无水乙醇 混匀 20 放置过夜以沉淀双链 cDNA 6 第二日 将昨日沉淀物在 4 13000g 离心 60 分钟以充分沉淀双链 cDNA 7 离心完毕 弃上清 加入 1ml 70 乙醇洗涤沉淀 常温下 13000g 离心 5 分钟 8 离心完毕 弃上清 干燥沉淀至无乙醇气味 注 第 3 第 4 步可以用 PCR 纯化试剂盒代替 PCR 纯化试剂盒操作流程 1 溶液 PE 使用前应加入适量体积 95 100 的乙醇 混匀 2 向 200ul 二链补平产物中加入 5 倍体积的 buffer PB 混匀 3 加入 spin column 中 13000rpm 离心 1min 4 加入 0 75ml buffer PE 13000rpm 离心 1min 5 13000rpm 再离心 1min 6 将 spin column 放入一新的离心管中 加入 50ul buffer EB 静置 10min 7 13000rpm 离心 2min 8 加入 30ul buffer EB 静置 10min 9 13000rpm 离心 2min 10 加入 1 10 体积 3M 的 NaAc 2 5 倍体积无水乙醇 混匀 20 沉淀过夜 4 EcoR I adaptor 加接加接 1 往双链 cDNA 沉淀中加入 9ul EcoR I adaptor 400ng ul 4 至少放置 30 分钟以充分溶 解 cDNA 沉淀 2 溶解完成后 顺序加入下列试剂 1 2ul 10 Ligase Buffer 1ul 10mM rATP 1 ul T4 DNA Ligase 4U ul 3 混匀后 4 连接 3days 或者 8 过夜连接 5 双链双链 cDNA 末端的磷酸化及末端的磷酸化及 Xho I 酶切酶切 1 连接反应完成后 将反应体系 70 放置 15 分钟灭活 T4 DNA Ligase 2 稍微离心使反应物集中至管底 室温下放置 5 分钟 然后加入下列试剂 1ul 10 Ligase Buffer 1ul 10mM rATP 6ul dd H2 O 1ul T4 PNK 10U ul 3 37 反应 30 分钟 然后 70 灭活 15 分钟 4 稍微离心使反应物集中至管底 5 室温放置 5 分钟 然后加入下列试剂 4ul Xho 10 Buffer 2ul BSA 5ul ddH2O 8ul Xho I 10U ul 6 37 反应 1 5 小时 然后 65 灭活酶 10 分钟 7 反应完成 双链 cDNA 合成完毕 置于 4 准备回收 6 胶回收胶回收 cDNA QIAEXII GEL Extraction Kit 回收试剂盒回收试剂盒 1 配制小胶数板 每个样品一板 1 琼脂糖凝胶 2ul EB 300ml 胶 2 取 4 保存样品上样 40ul 孔 3 电泳 50V 1hr 4 紫外灯下分别切下 500 1kb 1 0 2 0kb 及 2 0 4 0kb cDNA 片段 分别放入已做标记 的 1 5ml 离心管中 5 称取胶重 加入三倍体积 buffer QXI 例如 100mg 胶中加入 300ul buffer QXI 6 50 水浴数分钟 至胶完全融化 用手指弹 QIAEX II 使重悬 每管中加入 5ul QIAEXII 7 50 水浴 10min 每隔 2min 取出颠倒混匀数次 使 QIAEX II 保持悬浮 8 4 13000rpm 30sec 弃上清 离心机中甩一下 吸取上清 9 加入 500ul buffer QXI 轻弹管底使 QIAEX II 重悬 10 离心并去上清 同操作 8 11 加入 500ul buffer PE 重悬 QIAEX II 离心 30sec 去上清 12 再加入 500ul buffer PE 重悬 QIAEX II 离心 30sec 弃上清 离心机中甩 一下 吸去上清 13 超净台上吹干 至无乙醇味 加入 10ul elution buffer 重悬 QIAEX II 静 置 5min 13000rpm 30sec 吸上清 冰上放置 14