喜树组织培养体系建立

喜树组织培养体系建立喜树组织培养体系建立 生工 131 陈驰 摘要摘要 喜树 Camptotheca acuminata 是珙桐科 Nyssaceae 的一种落叶阔叶树 为优良 的园林绿化树种 喜树还可以产生具有抗肿瘤作用的喜树碱 分布于我国长江流域及西南 各省和印度部分地区 我国台湾 广西 河南等地也有栽培 喜树不仅是绿化树种 也是 具有抗癌功效的药用植物 本文概述了喜树组织培养中不同外植体的选择方法 总结了培 养条件中外植体的处理 激素和培养基的选择 以及附加物的添加 关键词关键词 喜树 组织培养 研究进展 愈伤组织 带芽茎段 茎尖 再生 喜树 Camptotheca acuminata Decne 为珙桐科 Nyssaceae 喜树属 Camptotheca Decne 植 物 又称旱莲木 是我国特有的植物 分布于长江流域及西 南各省 喜树不仅是一种优良的绿化树种 也是药用价值非 常高的药用植物 1966 年美国科学家 Monroe E wall 首先 发现喜树中含有一种次生代谢物质喜树碱 Compothecine CPT 该物质具有抗肿瘤活性 20 世纪 80 年代后期 喜树碱抗肿瘤作用 靶点作用机制被揭示后 有关喜树的研究成为了国内外生物学领域的研究热点 喜树以种 子繁殖为主 喜树种子以风力和重力为扩散动力 降雨及鼠类可引起微弱的二次扩散 扩散从 9 月上旬开始一直延续到次年 8 月末 但其有效扩散时间为 10 月至次年 3 月 扩 散距离越大 种子远距离分布的数量及其发芽率迅速降低 采取植物组织培养法进行喜树 的快速繁殖 有利于提高喜树种子的利用率 扩大繁殖系数 1 植物组织 细胞培养的应用研究植物组织 细胞培养的应用研究 植物组织培养 plant tissue culture 是指在无菌 条件下 将离体的植物器官 组织 细胞以及原生 质体培养在人工配制的培养基上 在适当的培养条 件下 使其长成完整植株的过程 据培养对象的不 同可分为 植株培养 胚培养 器官培养 细胞培 养 原生质体培养 植物组织和细胞培养是建立在 植物细胞全能性的理论基础上的 某部分的体细胞 脱离其原来器官或组织 在一定培养条件下 表现出全能性 全能性的实现除了取决 于它在原来所处的自然部位上已达到的细胞分化程度和生理状态 还必须满足将其处 于独立发育的离体培养条件下 并且赋予细胞一定刺激 即营养物质 激素等调控物 质 实现植物再生有两条途径 体细胞胚胎发生途径和器官发生途径 通常器官发生 是组培再生的主要途径 组培法进行无性繁殖可通过多种方法实现 主要有腋芽增殖 不定芽增殖 胚状体增殖 其中腋芽增殖途径变异小 常用于珍稀优良品种的繁殖和 保存 但增殖速度慢 胚状体增殖速度快 多用于人工种子和遗传转化研究 但易产 生畸形胚 不定芽增殖方法多样 可直接从外植体上分化产生不定芽也可脱分化形成 愈伤组织后进而器官分化形成不定芽 还可由悬浮细胞或是原生质体分裂 生长 分 化经器官发生和体细胞胚胎发生途径再生植栋 在组织培养研究中影响因素是多方面 的 主要是来自 1 培养材料的种类 所取外植体的部位与生理状态 2 培养基的种类和激素的配比与浓度 3 培养条件 包括温度 湿度 光照与通气 组织培养起步于 50 年代初期 主要 用于快繁脱毒 植物育种 单倍体培育 胚胎培育 原生质体培养与细胞杂交 生产有 用次生代谢产物 人工种子 种质保存等 目前通过组织培养能再生的植物种类已有 130 个科 1500 个种 2 培养条件的选择培养条件的选择 2 1 外植体处理外植体处理 外植体处理的方法有很多 种子 幼叶 茎段等外植体 经过蒸馏水清洗 酒精 消毒 0 1 HgCl 或 5 NaCl0 消毒 再次蒸馏水清洗后 将种子剥取种胚或切取 胚轴 或将幼叶和茎段切成合适大小 接种到培养基上 后置于 25 的恒温培养箱中 培养 每天光照 12 h 光照强度 1 500 2000lx 消毒剂对外植体进行消毒时 消毒时 间的长短会影响到接种后的污染情况 使用酒精进行消毒 酒精浓度一般为 70 75 消毒时间为 30 s 左右 使用 0 1 HgCl 消毒 时间为 3 10 min 为宜 使用 5 NaCl0 消毒 时间为 5 min 左右 种子的消毒时间要长于幼叶和茎段的消毒 时间 叶片和茎段等切块的大小也会对组织培养产生影响 外植体越小 切面与体积 的比率越大 伤害和褐变的程度就越大 因此 用完整的叶片作为外植体比切成小块 产生褐变的几率小 研究员认为 叶片剪成 1 5 cm 1 5 on 的小块作为外植体培养综 合效果最佳 2 2 培养基与激素培养基与激素 在喜树组织培养中常用的培养基有 MS I 2MS 改良 MS B5 N6 SH WPM 和 VW 培养基 常用的激素有 NAA 6 BA 2 4 一 D IBA 和 KT 激素主要分为生长素类 和细胞分裂素类 外植体培养过程中所 添加各激素的比例不同 所产生的促进 效果也一样 生长素类激素添加浓度高 时有利于根的发育 添加浓度比例低时 则有利于芽的发育 苯基噻二唑基脲 Thidiazuron TDZ 是一种人工合成的化合物 具 有植物生长素和细胞分裂素的双重作用 最近在植物组织培养上得到了较多应用 研 究表明 TDZ 在喜树愈伤组织培养中可替代植物激素 添加 1 mg L 的 TDZ 最适合组织 生长 添加 1 mg L 的 TDZ 0 5 mg L 的 NAA 可显著促进愈伤组织的生长及叶绿素的 积累 根据研究目的和选用外植体的不同 所选用的培养基和激素也不一样 WPM 是根 据木本植物的特点而创出的一种木本植物利用的培养基 以喜树的幼叶为外植体 以 WPM 为基本培养基 得到芽诱导的最佳激素组合为的 6 一 BA 19 8 斗 mol L NAA 5 8 mol L 根诱导的最佳激素为 IBA 9 6 ILL rnol L 建立了较好的植株再生系统 高桂珍等口 01 发现 以 B5 或 White 培养基与 NAA 0 5 mg L KT 0 1 mg L 组合来 进行喜树悬浮培养效果最佳 用喜树带芽茎段为外植体 通过正交试验分析得出影响 愈伤组织诱导率的主要因素是 BA 研究发现 MS 培养基对根的形成表现出一定的抑 制作用 1 2MS 和 WPM 培养基则适合喜树组培苗生根 2 3 附加物的添加附加物的添加 木本植物常常含有较多的酚类化合物 在组织培养中外植体或愈伤组织释放的酚 类化合物被多酚氧化酶氧化成醌类物质 而这些物质分泌到培养基中可导致整个组织 褐变坏死 通过添加一些抗氧化物 可以抑制这些褐化现象的产生 在以喜树离体胚 为外植体诱导芽增殖的培养基中加入 30 mg L 的柠檬酸 其愈伤组织诱导率可达 95 芽增殖系数达到 6 2 起到较好的抑制褐化的效果 在培养基中添加活性炭 抗坏血 酸 有效地抑制了愈伤组织继代培养中的褐化 3 继代与再生培养 继代与再生培养 组织培养中培养基营养和水分会减少 并积累了一定的代谢产物 根据外植体初 代培养的情况 一般在 30 d 左右需进行继代培养 随着愈伤组织的增殖或芽苗的增多 可将愈伤组织或芽苗切割后扩增繁殖 继代培养基根据需要可与初代培养基相同 也 可不同 若进行分化培养 可在初代培养基基础上添加特定激素来进行芽的诱导或根 的诱导 实验小组将初代培养的愈伤组织在 MS 6 一 BA 1 0 mg 2 牟 D 1 0 mg L 的培养基上继代培养 愈伤组织生长迅速 刘菲等 126l 发现在 MS 6 一 BA 2 0 mg L NAA 0 5 mg L 的培养基上继代培养出的愈伤组织适合于细胞悬浮培养 3 1 细胞悬浮培养体系的建立细胞悬浮培养体系的建立 取连续继代 4 次 质地疏松易 碎的愈伤组织 接种于附加 2 O mg L 6 BA 和 O 5m L NAA 的 MS sH B5 液体培养基中进行悬浮培养 观察培 养物状态 测定细胞生长量及喜树碱含量 悬浮培养条件 pH 值约 5 8 摇床转速 120 r min 100 mL 三角瓶中液体培养基为 80 mL 接种量约为 20 g L 培养周期为 20d 总结总结 喜树在我国的资源十分有限 通过采伐野生喜树资源提取药用成分会使成本过高 并 破坏生态环境 因而不能有效且节能的实现 通过喜树组织培养体系的建立会使这一情况 得到良好的解决 随着喜树组织培养和再生繁殖技术的不断深入 已经可以应用喜树茎尖 茎段 种胚 叶片等外植体通过愈伤组织或直接芽 根的诱导 经过壮苗移栽 从而得到 喜树的再生体系 为喜树药用成分含量提取和工业化等研究奠定了基础 以喜树幼叶为外植体 在不同的培养基上均可诱导出愈伤组织 从生长情况来看 作 为基本培养基对愈伤组织的形成更为有利 不同激素对诱导愈伤组织往往有不同的效果 诱导产生的愈伤组织在形态结构 生长能力 分化方向 次生代谢产物的合成能力等方面 有很大差异 2 4 D 较易诱导出愈伤组织 但不利于组织的分化 而 NAA 对喜树愈伤组 织分化成胚状体有促进作用 多种激素组合比单激素更有利于诱导出愈伤组织 从薄层层 析的结果可初步判断分化出的胚状体含有喜树碱 愈伤组织分化成胚状体与次生代谢产物 c 盯的产生有一定的相关性 参考文献参考文献 1 陈晓亚 叶和春 植物次生代谢及其调控植物科学进展 第一卷 北京 高等教育出 版社 1998 293 394 2 谭文澄 戴策刚 观赏植物组织培养技术 M 北京 中国林业出版社 1991 3 王洋 于涛 张玉红等 碱法提取喜树碱工艺的研究 J 木本植物研究 2000 20 4 433 437 4 田宝忠 喜树种子萌发更新潜力初探 贵州林业科技 2000 28 1 24 28 5 伊华林我国经济植物组织培养概况湖北农学院学报 2001 21 3 279 284 6 刘济明 雷基祥喜树种子的 d 然扩散贵州农学院学报 1997 16 2 13 19 7 Agarwal JS Rastogi PP Chemical constituents of Mappta foetida Miers Indian J Chem 1973 11 969 973 8 Aimi N Nishimura M Miwa A et aL Pumiloside and Deoxypumiloside plausible intermediates of campto