芍药苷提取分离研究报告2

前言前言 芍药苷主要来源于毛茛科植物芍药根 牡丹根 紫牡丹根 关于芍药的使用 我国很早就有书面记载 始载于 神农本草经 主邪气腹痛 除血痹 破坚 积 寒热疝瘕 止痛利小便 意气 我国明间用于治疗胸腹腰肋疼痛 自汗盗 汗 阴虚发热 月经不调 崩漏带下 现代研究表明其主要有效部位为芍药总 苷 赤芍提取物含芍药甙 Paeoniflorin 芍药内酯甙 Albiflorin 氧化芍 药甙 Oxypaeo niflorin 苯甲酰芍药甙 Benzoylpaeoniflorin 芍药吉酮 Paeoniflorigenone 芍药新甙 Lactiflor in 胡萝卜甙 Daucosterol 赤芍精 d 儿茶精 d Catechin 及没食子鞣质 Gallotannin 苯甲酸 Benzoic acid 挥发油 脂肪油 树脂 糖 淀粉 黏液质 蛋白质等 主 要成分为芍药苷 其具有镇静 解痉 抗炎 抗应激性溃疡病 扩张冠脉血管 对抗急性心肌缺血以及抑制血小板凝聚等多方面的作用 而且毒性小 临床上 已试用于治疗冠心病 老年性疾病 增强体质与免疫功能 抗炎止咳 祛痰平 喘等方面 尤其是老年慢性呼吸道疾病的治疗中可作辅助药物 理化性质理化性质 芍药苷 Paeoniflorin 又名芍药甙 化学名为 D Glucopyranoside 5 6 benzoyloxy methyl tdtrahydro 5 hydroxy 2 methyl 2 5 methano 1H 3 4 dioxacyclobuta cd petalen 1a 2H yl laR 1a 2 3a 5a 5a 5b 分子式C23H28O11 分子量 480 45 熔点 196 本品为吸湿性无定形粉末 四醋酸酯为无色针状结晶 属蒎烷单萜苷 极性较大 药典记载 芍药苷遇香草醛会显现蓝紫色 本次试验的意义在于通过改进分离工艺来提高芍药苷的分离效果 以便应 用于工业化大生产 仪器试剂仪器试剂 材料材料 赤芍干燥根切片 500g 由实验室提供 仪器仪器 名名 称称规格规格 或或 型号型号数量数量备备 注注 圆底烧瓶500 1000 2000mL 24mm各 1 只 球形冷凝管 400mL 24mm 2 1 支 烧杯100 1000mL各 1 只 锥形瓶250 1000mL各 1 只 铁架台1 副带铁夹 玻璃棒一根 克氏蒸馏头 24mm 2 一只 尾接管 24mm 2 1 支 数字恒温水浴锅 HH 2 型4 孔1 台国华电器有限公司 SHB 3循环水式真空泵 2 孔1 台郑州长城科工贸有限公司 布式漏斗 400mL 1 只 旋转蒸发仪1 台 展开缸1 个 蒸发皿1 个 玻璃板 5cm 10cm 25 块 三角瓶 50mL 20 个 层析柱 8 100cm 1 根 钢盆1 只 胶头滴管1 支 吸耳球2 个 量筒 10mL 1 支 移液管 0 50mL 1 支 具支试管 50mL 1 支 钉子漏斗1 个 烘箱一台 试剂试剂 名称名称规规 格格 厂家及批号厂家及批号用量用量 乙酸乙酯 CP 天津市东丽区天大化学试剂厂 20080218 3000mL 98 乙醇 4000mL 甲醇 CP 洛阳昊华化学试剂有限公司 060403 500mL 三氯甲烷 CP 天津市富宇精细化工有限公司 80423 500mL 活性炭 CP350g 硅胶 G CP 青岛海浪硅胶干燥剂厂 310g 有关芍药苷的提取常用水提 醇提以及超声三种方法 由于水提率不如醇 提 而超声又会影响芍药苷结构的稳定性 所以采用醇提 分离采用活性炭吸 附及硅胶柱层析 具体操作流程如下 流程图流程图 赤芍粉末 500g 70 乙醇回流 3 次 1h 次 合并提取液 过滤 药渣 滤液 减压浓缩 T 60 浓缩液 乙醇水溶液 回收 1500ml 水溶解 300g 活性炭吸附 过滤 滤液 活性炭 水洗至无色 过滤 活性炭 滤液 30 醇洗 醇水溶液 回收 活性炭 80 醇洗 直到 TLC 鉴定没有芍药苷 滤液 活性炭 减压浓缩 T 60 乙醇溶液 回收 浸膏 硅胶柱层析 干法 纯乙酸乙酯洗脱 洗脱液 减压浓缩至干 芍药苷 具体操作具体操作 醇水溶液回流提取醇水溶液回流提取 赤芍干燥根切片 500g 用粉碎机粉碎成细粉 取 250g 加入 2000mL 圆底烧瓶中 分别以 8 倍 6 倍 4 倍量 70 乙醇提取 3 次 每次提取 1h 每提取一次便浓缩一次 回收乙醇便可循环利用 合并 3 次的浓 缩液 另一半药材以同样的方式处理 合并所有的浓缩液 活性炭吸附分离活性炭吸附分离 取部分浓缩液稀释 加入活性炭吸附 过滤 将 滤液和原液进行硅胶薄层点样 喷以显色剂 观察活性炭是否能将芍药苷吸附 住 TLC 鉴别如下 展开剂 氯仿 乙酸乙酯 甲醇 甲酸 40 5 10 0 2 药典 显色剂 香草醛 甲醇 硫酸 5 80 15 配置方法 取 0 1g 香草醛 以 10mL 浓盐酸溶解 取其 2 5mL 溶液于显色喷 瓶中 加甲醇 40mL 再加浓硫酸 7 5mL 摇匀 即得 药典记载 芍药苷遇香草醛会显现蓝紫 色斑点 右边为吸附后滤液点样点 左边为吸附前样液 样点 箭头所指为蓝紫色斑点 由 TLC 鉴别可知 芍药苷可以被活性炭吸附 取 9 份 2mL 浓缩液 都稀 释到 10mL 加入等量的活性炭 3g 分别以 10 20 30 40 50 60 70 80 90 乙醇溶液洗脱 经 TLC 检测 40 及以上浓度的乙醇都能将芍药苷洗脱 而之前的都不能洗脱 部分点样如 下 从 右至左分别为 20 30 40 50 乙 醇溶液的洗脱液点样点 从上至下分别 为蓝紫色斑点 浅黄色斑点 点样点 由图可以判断芍药苷不能被 30 及更低浓 度的乙醇洗脱下来 但 40 及以上浓度的乙 醇都可以洗脱 将所有浓缩液与以上检测液合并 加 1500mL 蒸馏水稀释 加入 350g 经 105 活化 1h 的活性炭吸附 搅拌 0 5h 后过滤 滤液 TLC 检测没有发现蓝 紫色斑点 说明芍药苷完全被活性炭所吸附 滤出的活性炭先以自来水洗至 无色 再用 80 乙醇溶液进行洗脱 直到洗脱液经 TLC 检测没有蓝紫色斑点为 止 说明被吸附的芍药苷都被洗脱下来 将各次的洗脱液旋转蒸发浓缩 温 度应小于 60 洗脱剂的选择洗脱剂的选择 在进行硅胶柱层析之前应先选择合适的洗脱剂才 能得到较纯的分离物 提高分离效率及节约成本 取 3mL 浓缩液稀释至 10mL 作点样液 展开剂 氯仿 甲醇 8 1 分别为蓝紫色斑点 浅黄色 斑点 点样点 可见芍药苷与另一种物质的 Rf太接近 难以分离 展开剂 氯仿 甲醇 8 2 最右端为浓缩液 其余皆为稀释液 依次为浅红 蓝紫 棕黄 浅黄 点样点 展开剂 氯仿 甲醇 8 3 为蓝紫色斑点 但出现严重拖尾现象 作为洗 脱剂是不可取的 展开剂 纯乙酸乙酯 最右端为浓缩液 其余皆为稀释液 分别为浅红 蓝紫色 点样斑点 与 氯仿 甲醇 8 2 的展开 系统相比 既使芍药苷与极 性更大的物质如多糖 等分开又与极性小的物质如跑 在前面的红 色斑点分开 所以选择纯乙酸 乙酯作为上柱洗脱剂比较合理 硅胶柱层析分离硅胶柱层析分离 采用干法上柱 取 110g 旧硅胶 G 和 200g 新硅 胶 G 于烘箱中 105 活化 1 5h 用蒸发皿将浓缩液浓缩成浸膏 以适量 98 乙 醇溶解 与活化好的旧硅胶拌样 自然风干 再放到烘箱中 80 干燥 2h 取 8 100cm 层析柱 检测不漏水 塞上脱脂棉 松紧适宜 先以新硅胶 装柱 以吸耳球敲实整平 垫一张滤纸 再装干燥好的拌样旧硅胶 敲实整 平 再垫一张滤纸 以玻璃棒引流加入纯乙酸乙酯 打开活塞 开到最大 使乙酸乙酯排尽柱中的空气 当有液滴流出时 旋转活塞调节流速 2ml min 左右 用 50mL 三角瓶接取流份 30mL 份 TLC 检测 用药典展开剂氯仿 乙 酸乙酯 甲醇 甲酸 40 5 10 0 2 合并显色斑点相同的流份旋转蒸发浓 缩 从第 55 流份开始 只有红色斑点 253nm 荧光灯下观察无点 从第 73 流 份 开始出现蓝紫色斑点 而 80 到 90 第 90 流份借了 200mL 流份没有任何 斑点 从第 91 到 183 流份只有蓝紫色斑点 253nm 荧光灯下观察无点 接收 流份增至 50mL 份 之后到 186 流份没有斑点 卸柱 将 91 至 183 流份分步旋转蒸发浓缩 将浓缩液收集与 500mL 输液瓶中 在收集过程中有白色粉末析出 部分粉末结块于瓶底 加热只有部分能溶解 加少量甲醇完全溶解 过滤 转置 50mL 锥形瓶中自然结晶 不成 冷冻干燥 得干粉 称重 3 1g 鉴定鉴定 TLC 鉴定显蓝紫色斑点 展开剂 氯仿 乙酸乙酯 甲醇 甲酸 40 5 10 0 2 药典 显色剂 香草醛 甲醇 硫酸 5 80 15 紫外检测再 230nm 处有最大吸收峰 为芍药苷特征吸收峰 高效液相测定 供试液制备 精密称定芍药总苷 24mg 置经洗净的 10mL 容量瓶中 加甲醇溶解稀释至刻度 摇匀 密塞 即得 色谱条件 S Gel C18 5um 色谱柱 流动相 甲醇 水 35 65 柱温 室温 流速 1mL min 检测波长 230nm 进样量为 20uL tR 5 65 0 25min 对峰面积进行计算 其中 230nm 处主峰所占比例为 87 37 即芍药苷含量为 87 37 结果结果 经 46 天试验得到淡黄色芍药总苷冷冻干燥粉 3 1g 经高效液相测定芍 药苷含量为 87 37 讨论讨论 药材提取浓缩液出现沉淀问题 醇提水沉 赤芍粉末经醇提过滤浓缩 静置一夜后 棕色浓缩液中出现了 褐色的沉淀 轻摇即散 没有将其过滤出来进行检测 活性炭吸附洗脱问题 采用活性炭吸附时 一定要在水溶液中进行 在醇溶液中是不能吸附或吸 附效果极差的 但实际操作中 没有将醇提液浓缩成浸膏再以水溶解 而只是 将其浓缩至闻之没有乙醇的气味便加入了活性炭 能完全吸附含侥幸成分 洗 脱时 一定要先用水洗至无色 洗掉色素及其他杂质 再用 30 的乙醇洗掉部 分杂质 但实际操作中 没有以水洗至完全无色 而且只用 30 乙醇洗了一遍 以致残留 了许多杂质 上柱后各接收流份处理及不能结晶问题 上柱后各物质相对被分开 极性小的物质最先被洗脱下来 出现杂质种类 多含量少的现象 而且这些杂质在 253nm 荧光下都有斑点 但从第 55 流份到 72 流份只有红色斑点的物质 253nm 荧光灯下观察无点 将其单独收集 但在最后的浓缩处理过程中 不颠将其掉入水浴锅 虽然进行 了抢救 将水浴锅中的水引出 糖瓷盘中蒸发干 以甲醇溶解过滤 点样 红 色斑点依旧在 但已不明显 放置一段时间后 容器壁上有水垢状物质结出 溶液点样已基本看不到红点 弃去 91 到 183 流份只有蓝紫色斑点 253nm 荧光灯下观察无点 应为芍药苷 将其单独收集 每 500mL 洗脱液浓缩一次 乙酸乙酯循环利用 采用旋转蒸发 浓缩至有微粒混悬为止 用胶头滴管转置 500mL 输液瓶中 随着浓缩液的增多 在放置过程中析出的白色沉淀越来越多 水浴 80 加热 只有部分溶解 加入 少量甲醇便完全溶解 旋转蒸发至干 甲醇溶解过滤 于 50mL 锥形瓶中结晶 随着甲醇的挥发 溶液越来越浓 但沉淀一直没有析出 液体的颜色也越来越 深 由之前的浅黄向红色转变 有可能部分芍药苷已分解 因为芍药苷暴露于 空气中或长期见光易被氧化分解使颜色加深 变成红棕色或红褐色 为减少损 失 将甲醇蒸干 用少量蒸馏水溶解 转至蒸发皿中 液面高度不能超过 1cm 于冰箱中冻结成冰 再进行冷冻干燥 得芍药总苷的冷冻干燥粉 得不到结晶的原因分析 芍药苷在甲醇中溶解度过大 乙酸乙酯 洗脱浓缩液有结晶析出时 没有及时的将其滤出 以致后来引入杂质增多难以 结晶 个人推测 由试验可以看出芍药苷在乙酸乙酯中的溶解度并不大 但要 使芍药苷能够结晶 必须先制成过稀溶液 再旋转蒸发浓缩至有混悬现象出现 的过饱和溶液便可析出可滤出的成形沉淀 收稿日期 收稿日期 2008 6 82008 6 8 试验日期 试验日期 2008 03 312008 03 31 至至 05 1605 16 参考文献参考文献 1 国家药典委员会 中国药典 部 S 北京 化学工业出版社 2000 125 2 马双成 邓少伟 赤芍总苷的生产工艺研究