中药中黄曲霉毒素的检测.ppt

中药中黄曲霉毒素的测定 目录 真菌毒素简介黄曲霉毒素概述黄曲霉毒素现有检测方法介绍黄曲霉毒素检测药典收载情况药典检测方法详解注意事项及实验室建议 真菌毒素简介 真菌毒素 由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物 由真菌菌核产生 Mycotoxin 源于希腊语 Mykes 和拉丁语 Toxicum 常见真菌毒素分类 真菌毒素监控意义 真菌毒素对食品安全的危害真菌毒素对种 养殖业的危害真菌毒素对制药行业的危害 中药 国际贸易中作为技术壁垒在国际反恐和战争中 真菌毒素可作为大规模杀伤性生化武器 黄曲霉毒素概述 黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生的次生代谢产物 黄曲霉毒素的发现 1960年 在英国东南部一些农场中 有大约10万只火鸡不明原由地突然死亡 1961年发现火鸡饲料中混有的花生粉能够使大鼠诱发肝癌 1962年 研究发现花生粉中含有一种荧光物质是导致 火鸡死亡的病因 这种荧光物质被证实为黄曲霉的代谢产物 故命名为 黄曲霉毒素 Aflatoxins 存在极其广泛 主要存在于土壤 动植物及各种坚果中 家庭自制发酵食品等也经常发现黄曲霉毒素 一般在热带和亚热带地区 食品中黄曲霉毒素的检出率比较高 未能及时晒干或储藏不当的粮食容易产生 在农作物正常的生长期中也可以形成 毒性极强 1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织 WHO 的癌症研究机构 IARC 划定为 类致癌物 是一种毒性极强的剧毒物质 仅次肉毒毒素 是目前已知霉菌中毒性最强的 急性毒性 比氰化钾大10倍 比砒霜大68倍慢性毒性 肝脏损害 呈急性肝炎 出血性坏死 肝细胞脂肪变性和胆管增生 脾脏和胰脏也有轻度的病变 中药中容易产生黄曲霉毒素的品种 种子 果实 粮谷类中药材发酵类中药材动物类中药材油性成分多的中药材含上述种类药材的中成药 黄曲霉毒素的种类及性质 根据在紫外线照射下产生荧光颜色的不同 分为B族和G族两大类及其衍生物 蓝色荧光 黄绿色荧光 化学结构 基本结构 是一组化学结构类似的二呋喃香豆素的衍生化合物目前发现约20余种 已分离鉴定出12种 B1 B2 G1 G2 M1 M2 P1 Q H1 GM B2a和毒醇 B1 最常见 毒性及致癌性最强 化学结构式 理化性质 黄曲霉毒素相对分子量312 346难溶于水 易溶于油 甲醇 丙酮和氯仿等有机溶剂 但不溶于石油醚 己烷和乙醚在中性及酸性溶液中较稳定 但在pH为1 3的强酸性溶液中稍有分解 在pH为9 10的碱性溶液中分解迅速 纯品为无色结晶耐高温 黄曲霉毒素B1的分解温度为268 紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性 黄曲霉毒素现有检测方法介绍 薄层层析法 灵敏度低 定量困难HPLC 紫外检测法 不衍生 灵敏度低 采用UPLC可以增强灵敏度HPLC 荧光检测法 需衍生 灵敏度高高效液相色谱 串联质谱法 不需衍生 灵敏度高 假阳性少 成本高 免疫化学分析方法 酶联免疫吸附法 快速 简便 单一毒素 假阳多 免疫亲和柱 荧光分光光度法 高效 无毒 假阳多 微柱筛选法 半定量 测总量 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法 快速 现场大批量初筛 黄曲霉毒素检测药典收载情况 2005年增补本附录第一次增加了黄曲霉毒素测定法2010年版一部 正文 僵蚕 陈皮 酸枣仁 桃仁 胖大海品种项下增加了黄曲霉毒素残留量检查 附录 继续收载了黄曲霉毒素测定法 2010年版一部第二增补本修订了附录方法 删除了流速规定 增订了另一种衍生方法 即光化学衍生法 取消了免疫亲和柱的品牌规定2015年版四部通则2351黄曲霉毒素测定法 增加了第二法 高效液相色谱 串联质谱法 增加附注 当测定结果超出限度时 采用第二法进行确认 2015年版四部通则增加中药中真菌毒素测定指导原则 基本原则 中药中真菌毒素的分类 监控品种 测定方法 限值拟定 基本内容 高效液相色谱法 高效液相色谱 质谱联用法 2015年版四部通则9302中药有害残留物限量制定指导原则中关于黄曲霉毒素的规定 由于黄曲霉毒素毒性强 目前国际上不建议设定黄曲霉毒素的安全耐受量和无毒作用剂量 也无最大限量理论值计算公式 限量越低越好 中国药典 2015年版正文收载品种 根及根茎类 远志果实种子类 大枣 肉豆蔻 决明子 麦芽 陈皮 使君子 柏子仁 胖大海 莲子 桃仁 槟郎 酸枣仁 薏苡仁动物类 僵蚕 水蛭 地龙 全蝎 蜈蚣 共19种 较2010年版药典增加14种 黄曲霉毒素药典检测方法详解 液相条件 C18 甲醇 乙腈 水 40 18 42 衍生方式 柱后碘衍生 柱后光化学衍生混合对照品溶液的制备 液体标液 B1 B2 G1 G2 1 0 3 1 0 3ug ml 梯度稀释500倍 供试品溶液的制备 15g粉末 3gNaCl 70 甲醇提取 免疫亲和柱纯化测定 吸取混合对照品溶液5 l 10 l 15 l 20 l 25 l 注入色谱仪 绘制标准曲线 吸取供试品溶液20 25 l 测定 方法来源 中国药典 2015年版四部通则2351黄曲霉毒素测定法基本步骤 提取 净化 活化 上样 洗杂 洗脱 测定 随行质量控制 质控样 随行加样回收 泵流操作架 免疫亲和柱 HPLC 荧光检测器 光化学衍生器 自动固相萃取仪 净化步骤 取15ml 离心后的提取液 加水至50ml滤过 取20ml 通过免疫亲和柱 流速3ml min加水洗涤两次 每次10ml过空气10秒 将水挤出柱子分次加甲醇1 5ml 自然洗脱 过空气 定容至2ml 免疫亲和柱的原理 利用抗原 抗体免疫反应的原理 使用大剂量的单克隆抗体 选择性的将样品提取液中的黄曲霉毒素吸附 用水将杂质洗脱除去 再用甲醇定量将黄曲霉毒素洗脱 达到分离净化目的 黄曲霉毒素 单克隆抗体 杂质 黄曲霉毒素的衍生化 衍生原因黄曲霉毒素B1 G1荧光遇水要淬灭 检测前需要衍生化 药典附录收载的两种衍生方法 碘衍生法 碘作为衍生剂 对衍生温度有要求 试剂对仪器有腐蚀性 需要冲洗 光化学衍生法 紫外光灯 254nm 照射 操作简单 对衍生温度无要求 不需要其他衍生剂 无需冲洗对黄曲霉毒素B1和G1进行衍生 黄曲霉毒素B2和G2不受该衍生步骤的影响 AFB1 AFG1 黄曲霉毒素的衍生化 黄曲霉毒素的衍生化 结果报告 低于检测限 标出检测限 报告具体值 未检出 限度内 限度外 报告具体值 方法难点 痕量分析 ppb级 要求高灵敏度毒性强 具有一定的风险性 安全防护措施基质复杂 注意事项 取样的代表性黄曲霉毒素在样品中分布不均匀免疫亲和柱的使用储存 使用温度 使用说明书 安全防护操作人员专门培训 全程穿工作服佩戴手套 注意事项及实验室建议 对照品的使用使用黄曲霉毒素混合对照品 不使用黄曲霉毒素固体纯品自行配置对照品贮备液避光 低温 密闭保存 工作液现配现用 试验废弃物处理残留有黄曲霉毒素的废