MultiplexPCR

多重PCR技术,Multiplex PCR,讲究框架,多重PCR技术原理多重PCR实验设计多重PCR条件优化技术应用,多重PCR技术原理,PCR是什么：聚合酶链式反应。是一种体外快速扩增特定基因或DNA片段的分子生物学技术。,多重PCR技术原理,其基本原理是：以一对寡核苷酸为引物，在模板DNA、dNTP、适当缓冲液Mg2+的混合体系中，在DNA聚合酶的催化下，根据碱基互补配对原则，对引物所界定的DNA片段进行扩增。这种扩增通过模板DNA与引物之间的变性、退火和延伸三个步骤为一循环，每次循环产生的DNA片段作为下次 循环的模板，所以PCR扩增产物呈指数增加。,多重PCR技术原理,多重PCR技术原理,多重PCR是在传统PCR原理的基础上进行改进，即在同一体系中加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的DNA片段。,多重PCR技术原理,1、扩增单一基因中多个片段2、扩增不同基因中多个片段,多重PCR实验设计,列举实例：多重PCR检测牛病毒性腹泻1型、2型及猪瘟病毒方法的建立,多重PCR实验设计(大致的如何操作),所要求的东西主要是：病毒株、接种细胞、培养基、试剂主要试剂：核酸提取相关试剂、Taq DNA聚合酶、dNTPs等等主要仪器：PCR仪、恒压恒流电泳仪、凝胶成像仪、常温离心机、振荡器等等,多重PCR实验设计提取模板,在牛胚肾细胞（MDBK）上大量增殖病毒，并做核酸检测，确保每代病毒正常增殖,多重PCR实验设计引物设计,1、引物位置的确定：首先需要知道所选择的基因引物位点的详细DNA序列信息。引物的DNA序列应该有很强的特异性，否则引物会结合在其他位点上发生非特异性扩增。2、引物序列的测定：引物的设计是多重PCR成功的重要保证：事先通过GDB（基因数据库）、NCBI（生物技术信息中心）查引物相关位点的DNA序列信息。3、引物序列的比较：引物间连续互补不能超过4bp，以防止发生交叉错配。,多重PCR实验设计引物设计,12 13 Kb 5UTR ORF 3UTR 约380bp,多重PCR实验设计引物设计,多重PCR实验设计引物设计,多重PCR实验设计多重PCR反应条件的确定,首先进行单个PCR，分别设定各引物对反应条件。然后，依次增加引物对，不断调整反应条件直至最后保证所有的引物对都能在同一条件下扩增出目的条带。,多重PCR实验设计退火温度,利用梯度PCR仪摸索一个合适的退火温度,多重PCR实验设计预期结果,多重PCR条件优化,多重PCR是在传统PCR基础上改进并发展起来的，但并不是单一PCR的简单混合，在实际操作中常常受到反应条件和反应体系等多种因素的影响。,多重PCR条件优化,多重PCR技术的难点主要体现在前期引物设计过程中以及反应体系的各种平衡问题。,多重PCR条件优化,0.85*0.85*0.85=0.61,85% 85% 85%,多重PCR条件优化反应体系优化原则,1、确保所有的靶位点可以用相同的PCR程序在单个反应中得到有效的扩增；2、在使用相同的PCR程序和反应条件的单个PCR中对每对引物的量进行优化，以达到最大的扩增效率；3、平衡多重PCR中每对引物的量，使之对每个靶点都能获得足够的扩增量。,多重PCR条件优化引物设计（关键优化）,多重PCR中的每对引物必须满足单引物PCR体系的引物设计原则。这些原则包括：引物与模板的序列紧密互补，长度一般为1530bp，GC含量一般为4060；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。由于多重PCR体系中同时存在多对引物，在引物设计时还应注意：各引物对必须保持高度的特异性，避免非特异扩增；尽可能避免所有引物间的相互作用，各引物对应保持相对一致的扩增效率，且不同引物对扩增出来的产物能通过电泳或其他方法区分开。,多重PCR条件优化模板核酸的量,模板核酸的量和纯度是PCR成败的关键环节之一。模板量太少，会出现阴性结果或条带很弱；模板量太多则会出现条带弥散，模糊不清；模板纯度低或被降解会导致扩增的不整齐。模板核酸片段还必须具有高度的特异性，以避免非特异性扩增，保证检测的准确性。另外，各片段长度应具有明显差异，以有利于扩增后产物的区分。,多重PCR条件优化循环参数的优化,在传统PCR反应中，一个体系通常采用一个退火温度。在多重PCR体系中，不同长度的模板核酸片段、不同的引物对所要求的退火温度不一样。学者通过研究证实，在25uL的反应体系中含有多个退火温度的多重PCR反应条件的扩增效果比采用一个退火温度的效果好，基本能满足多重PCR的要求。一般来说，在解链温度Tm值允许范围内，选择较高的退火温度。,多重PCR条件优化循环参数的优化,多重PCR的退火时间比传统PCR稍微延长，有助于引物与模板的完全结合。延伸时间则要根据模板核酸的长度决定。经过反复的优化实验发现，多重PCR的延伸时间比传统PCR循环时延伸时间为40s长，他们认为循环时延伸时间为1min的扩增效果好，扩增产物加尾整齐。,多重PCR条件优化反应体系优化,由于多重PCR体系中加入多对引物，因此反应体积和反应体系中的各成分也应做相应的调整。有学者通过实验认为，20uL与15uL的反应体积能达到多重PCR扩增要求，并同时对PCR缓冲液进行了改进，认为多重PCR理想的缓冲液为：1.5mmol/LMgCl，50mmol/L KCl，10mmol/L HCl pH=8.3，1mmolL TMAC，0.01明胶。同时有研究表明Mg2+浓度与dNTP浓度有相关性，对于一个25uL的反应体系，当Mg2+浓度为1.5mmolL时，dNTP推荐浓度为200 umolL。多重PCR反应体系中，不同的反应会不同程度的竞争DNA聚合酶，因此在反应体系中适当多加入一些DNA聚合酶，可获得更佳的扩增效果。,技术应用,高效性：在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一份样本中就可检测多种病原体。,技术应用,系统性：多重PCR很适宜于成组病原体的检测肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，如：甲、乙、丙型肝炎病毒重叠，乙、丙型肝炎病毒重叠等；肠道致病性细菌的检测，如伤寒、痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾、霍乱同一个病人并同时发病； 生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌、产气荚膜杆菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌等的质检。,经济简便性：多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。,技术应用,存在问题,多重PCR在实际应用中一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳