精浆的生化检验技术三修

1,2,精 浆 生 化 检 验,郑大三附院检验科 袁恩武 二00八年七月,3,一 、精浆的来源及作用 二、 精浆-葡萄糖苷酶测定 三、 精浆果糖测定 四、 精子顶体酶的测定 五、 其他生化项目测定,4,一 、 精浆的来源及作用,男性生殖系统的结构,外生殖器内生殖器,阴囊阴茎,生殖腺（睾丸）、输送管道（附睾、输精管、射精管和尿道）和附属腺体（精囊、前列腺、尿道球腺）,5,男性生殖腺分泌功能睾丸:精子、雄性激素、转铁蛋白、附睾 : 中性-葡萄糖苷酶、肉毒碱、甘油磷酸胆碱、唾液酸等，与精子的功能性成熟有关精囊腺: 分泌果糖、前列腺素等，呈碱性前列腺: 分泌酸性磷酸酶、柠檬酸、谷氨酸转肽酶、PSA、锌、镁等，其分泌物呈酸性,6,精液的组成和来源精液是由精子和精浆组成的混合物精子产生于睾丸精浆产生于附睾、前列腺、精囊腺和尿道球腺等附属腺体正常精液中精子占5%，精浆占95%在精浆中约30%来自前列腺，60%来自精囊腺，5-10%来自于附睾及尿道球腺,7,8,正常精浆应具备 精浆量2.0ml 外观和粘稠度都正常 PH值7.2-7.8 精浆各项生化指标正常 精液WBC 1106/ml 细菌培养阴性或细菌计数1000/ml,9,精浆主要化学成分水:约占90%以上糖类:果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等蛋白质:白蛋白及非酶蛋白质脂类:包括胆固醇、睾酮、前列腺素等酶蛋白:酸性磷酸酶、透明质酸酶、糖苷酶、精素、纤溶酶原激活剂等,10,肽类激素：如FSH 、LH、催乳素等 胺类：如精胺、亚精胺、精胺素等氨基酸：如精氨酸、谷氨酸等20多钟 有机酸及有机碱：如柠檬酸、肉毒碱、甘油磷酸胆碱、乳酸等 无机离子：锌、镁、钙、铜、钾、氯、钠等,11,精浆的生理作用 作为一种介质把精子输送到女性生殖道内，为 精子提供营养物质 参与精液的凝固和液化 精浆组成一个适当的pH值和渗透压环境，具有一定的缓冲能力，以适应精子活动的需要 精浆中含有调节输卵管及子宫活动的物质，同时还含有使宫颈粘液水解的物质。,12,精液的凝固与液化精液刚射出时为一粘性、略呈灰黄色的液体，射出后立即呈胶冻样凝块，520min后又会自动液化，并仍呈一定粘度。当精液射于阴道内5min可以完全液化，比体外液化的时间为快,13,精液液化一旦形成，精子在此液状环境中才开始有效的自由活动，且有充分活动力，可由阴道进入宫颈、子宫及输卵管，最后与卵子结合而致孕。精囊（凝固酶）和前列腺（液化因子、PSA）在精液的凝固和液化过程中起重要作用,14,男性不育疾病中精浆生化指标的改变,15,精浆生化检验的目的 精子功能指标：评价精子受孕能力 用于男性生殖道炎症的诊断 了解副性腺功能 确定梗阻性无精子症及梗阻部位,16,男科实验室开展的精浆生化项目 精浆-葡萄糖甘酶测定 精浆果糖测定 精浆酸性磷酸酶的测定 精子顶体酶的测定 精浆锌的测定 精浆乳酸脱氢酶X同工酶的测定 精浆柠檬酸定量测定,17,二、精浆中性-葡萄糖甘酶测定（酶法）,检测目的 主要是附睾分泌功能的指标，较左旋肉毒碱和甘油磷酸胆碱对附睾更敏感、更特异 先天性副睾发育不良明显降低、急慢性副睾炎降低 正常见于单纯输精管阻塞无精症,18,原理 P-硝基酚吡喃葡糖苷 （底物） 对硝基酚（产物） 淡黄色物质，在405nm波长有最大吸收峰加酸是抑制酸性-葡萄糖甘酶 ，保护中性-葡萄糖甘酶,加 酸,-葡 糖 苷酶,Na2CO3,19,试剂组成酸性抑制剂 600l1瓶糖苷酶抑制剂（冻干粉） 1瓶底物（冻干粉） 2瓶终止液 50ml1瓶标准品（15） 各2.5 ml质控液 100l1瓶底物溶解液 5 ml1瓶,20,实验设备及用具酶标仪低速自动平衡离心机微量水平振荡器水浴箱 （37）精密移液器（加样枪） 0.520ul、50200ul、100500ul、 2001000ul石英定时钟,21,实验操作方法试剂准备糖苷酶抑制剂冻干粉以120l蒸馏水溶解，4可使用20天，分装保存-20可长期使用（切勿反复冻融）每瓶底物冻干粉以2.2ml底物溶解液充分溶解，分装保存溶解后的底物液，4保存可用5天，-20保存可用数月（切勿反复冻融）,22,标本准备记录受检者一次射精的精液总量(ml)精液液化后以3000g离心10分钟，保留精浆若样本不能立即测定，可以Eppendorf管分装精浆，-20保存待检根据离心力计算离心速度公式,N：离心速度 Rcf：离心力 R：离心半径,23,操作方法,24,比色与计算 计算标准管浓度对应的标本浓度值 1单位（U）葡糖苷酶活性=37下每分钟产生1umol PNP 标本系数=总孵育体积样本体积反应时间(min) =1115525=8.92标准管浓度对应的标本浓度值(umol/L)=标准管实际浓度8.92,25,各标准管计算浓度如下,26,根据酶标仪功能选择比色计算方式直接计算检测样本浓度（适用于可设置多样本空白的酶标仪，如：BIO-TEK ELx800系列等）方式： 酶标仪可为每个测试孔（包括标准和待检标本）设置空白，并自动完成每例A的计算，然后根据A拟合曲线，直接计算出检测标本浓度,27,各检测孔在微孔板上的位置排列方式如下,1 2 3 4 ,A S1 R3 R3B B S2 R4 R4B C S3 R5 R5B D S4 R6 R6B E S5 R7 R7B F Q QB R8 R8B G R1 R1B R9 R9B H R2 R2B ,S：标准孔 Q：质控孔 QB：质控对照孔 R：标本测定孔 RB：样本对照孔,28,Bio-Tek ELx800酶标仪程序设置，主要参数如下MAPPING DIRECTION: DOWN;BLANK MAP: P-DOWN;ENTER NUMBER OF STANDARDS: 05ENTER NUMBER OF STANDARD REPLICATES: 01CONCN. OF STD1: 0 CONCN. OF STD2: 4.46 CONCN. OF STD3: 8.92 CONCN. OF STD4: 17.84 CONCN. OF STD5: 35.68 按“平滑曲线”方式拟合标准曲线酶标仪打印输出结果，即为检测标本真实浓度（U/L）,29,优点 仪器可设置多样本空白，直接计算待检样本浓度缺点 操作繁锁（对酶标仪操作技术要求较高） 浪费试剂 每次试验最好作标准曲线,30,通过人工计算检测样本浓度（适用于不能设置多样本空白的酶标仪，如大多数普通酶标仪）酶标仪对空白处理方式有限，但可设置一个空白孔单孔，所有检测孔吸光度均为之相减。,31,各检测孔在微孔板上的位置排列方式如下：,A B R1 R5 B S1 R1B R5B C S2 R2 R6 D S3 R2B R6B E S4 R3 R7 F S5 R3B R7B G Q R4 R8 H QB R4B R8B ,1 2 3 4 ,B：空白孔 S：标准孔 Q：质控孔 QB：质控对照孔R：标本测定孔 RB：样本对照孔,32,设置酶标仪程序时，标准浓度输入值分别为0、4.46、8.92、17.84和35.68。按“平滑曲线”方式拟合标准曲线人工计算方法：检测管实际浓度(U/L)=检测管浓度-对照管浓度。 如：质控管实际浓度=QQB 标本1实际浓度=R1R1B,33,结果报告 标本最终检测结果以“精浆中性-葡糖苷酶总活性”方式报告，即总活性=标本浓度(U/L)一次射精的精液体积(ml)=mU/一次射精正常参考值20 mU /一次射精（WHO）,34,试验中注意事项严格控制禁欲时间和样本离心速度操作时加样要准确，混匀充分底物液直接于37水浴状态加入反应完毕迅速加入终止液每个样本必须做样本空白对照,35,掌握好温度和孵育时间质控液不能加酸性抑制剂比色前微孔板应进行充分振荡（非常重要）糖苷酶抑制剂溶解后应迅速分装，-20冷冻保存底物见光易分解，注意蔽光保存,36,质量控制目的 评价精浆-葡糖苷酶检测中离心速度、禁欲时间、以及冻融对精浆-葡糖苷酶水平的影响，为精浆-葡糖苷酶检测实现标准化及实验室内部和实验室之间的质量控制提供指导不同速度离心后的精浆中-葡糖苷酶水平见表1、,37,表1 精浆-葡萄糖苷酶在精浆标本2000r/min 离心10min和3500 r/min离心15min结果比较,两组结果比较*: P = 0.001,38,不同速度离心后的精浆中精子密度的比较 精液经2 000 r/min离心10 min后，84.31%（43/51）的精浆含有精子，平均精子密度为(2.433.95)106/ml，而经3 500 r/min离心15 min后，23.53%（12/51）的精浆含有精子，平均精子密度为（0.220.87）106/ml，结果见图1。,39,图1 不同速度离心后的精浆中精子密度的比较,40,冻融后的精浆葡糖苷酶的检测结果所有6份标本加与不加PMSF对-葡糖苷性检测没有影响（P 0.05）。连续20天（隔一天检测一次）的检测结果表明，6份标本的CV为2.22%5.29%。见表2,41,表2 精浆样本在加入PMSF和未加入PMSF后活性变化情况,CV(%),42,不同速度离心后的精浆-葡糖苷酶水平与禁欲时间的关系见表3、图2,43,表3 精浆中-葡萄糖苷酶在不同的禁欲期间离心 2 000 r/min10 min或 3500 r/min15 min结果比较,2 3 天比较, *: P 0.05;4 5 天比较, #: P 0.05; 6 7天比较, : P 0.05,44,图2不同禁欲时间与-葡萄糖苷酶活性相关系数,标本离心2000 r/min,标本离心3500 r/min,45,2 000 r/min离心后的精浆及3 500 r/min离心后的精浆中-葡糖苷酶水平与禁欲时间之间的相关系数（r）分别为0.538和0.486(P均0.001)。提示，随着禁欲时间的延长，精浆-葡糖苷酶水平不断升高。,46,在精浆-葡糖苷酶的检测中，应该注意离心速度对结果的影响，要想得到单纯的精浆，离心速度3 500 r/min，只有如此，各实验室之间的检测结果才具有可比性,47,精浆-葡糖苷酶水平检测的最佳禁欲时间最好为47天，即精浆-葡糖苷酶检测中禁欲时间亦应标准化，应规定为47天对-葡糖苷酶活性检测来说，冷藏精浆标本可作为不同实验室之间的质控品,48,果糖含量直接反映精囊分泌功能，间接反映睾丸间质细胞分泌睾酮功能结合-葡糖苷酶用于判断先天性输精管精囊发育缺陷无精子症和阻塞性无精子症的判断:如下表,三、 精浆果糖的测定（酶法）,49,试验原理果糖5-酮基果糖 甲替类化合物（淡黄色）其在490nm处有最大吸收峰，其颜色深浅与果糖含量成正比,特异性酶,脱 氢,递氢体,50,试剂组成缓冲液酶液（冻干粉）显色剂终止液酶液（冻干粉）溶解液果糖标准液标本稀释液实验设备及用具 同-葡萄糖苷酶测定,51,操作方法试剂准备每瓶酶液冻干粉加0.6ml酶干粉溶解液溶解，室温溶解30min，待用溶解后的酶液4保存可用1月，分装后-20保存至少可用1年（切勿反复冻融）临用前配制工作液，方法是：缓冲液显色剂=91，充分混匀，待用,52,标本准备新鲜精液液化后，迅速取部分精液2000g离心10分钟，留取精浆立即检测或-20储存待分析检测前，将待检精浆标本用样本稀释液1:4稀释，充分混匀制备标准曲线将8mmol/L果糖标准液用样本稀释液稀释为4、2和1mmol/L三个浓度,53,检测步骤,54,比色与计算标准管浓度对应的标本浓度值(mmol/L)=标准管实际浓度4。各标准管计算结果如下,55,直接计算检测样本浓度酶标仪同-葡萄糖苷酶测定，只是多了一个标准空白孔人工计算检测样本浓度方法同-葡萄糖苷酶结果报告方式报告：“mol/一次射精” ， 一次射精果糖量(mol)=精浆果糖浓度(mmol/L)一次射精的精液总体积(ml)参考值：一次射精13mol(WHO),56,注意事项果糖标准液配好后4放2周后使用，期限约为2周即需更换（若为成品试剂盒应在1月内用完）严格按要求留取精液标本精液液化后应立即离心将精子和精浆分开糜蛋白酶对精浆果糖检测没有明显影响，不液化精液样本，可预先加酶处理,57,离心速度对精浆果糖浓度的影响不大冻融对精浆果糖水平没有明显的影响，冻融精浆可以作为监测不同实验室果糖检测的质控品标本检测结果出现极低值时，注意观察样本A值和零标准A值，结合标准曲线判断,58,精浆果糖检测标准化和管理果糖标准液吸光度的监测果糖标准液连续监测35天的OD值见图1图1 果糖标准液OD值随时间变化,59,精液放置时间对果糖浓度的影响48份精液标本液化后立即（0 h组）、2 h（2 h组）和4 h（4 h组）后3500 r/min离心15 min分离精浆，所得果糖浓度见表1,60,表21 在精液0, 2, 和 4 小时液化过程中比较精浆标本果糖含量（配对t检验）,0小时组比较, *: P=0.004, #: P=0.000 2小时组比较, $: P=0.006,61,精液放置后果糖浓度的降低与精子浓度和活动率密切相关将每份标本0、2、4 h的果糖值通过Excel作图求出斜率（K），以代表每份精液标本果糖的降低速率将每份精子的活率乘以精子浓度得到活动精子浓度，再将两者进行相关性分析r =0.374，P = 0.009，提示精液果糖浓度降低与活动精子浓度呈显著正相关，结果见图2,62,图2 精浆果糖浓度降低速率（K） 与活动精子浓度之间相关性,63,检测意义结构：丝氨酸蛋白溶解酶，属于膜结合性酶功能：水解卵细胞的透明带及卵黄膜以达成一条通道，便于精-卵结合完成受精过程顶体酶活性可反映精子质量，是判断男性精子功能和生育力强弱的重要评价指标,四、精子顶体酶活力的测定,64,试验原理BAPNA 硝酰基苯胺BAPNA:N-苯甲酰-DL-精胺酸-硝酰基苯胺（410nm)试剂抑制剂缓冲剂终止液底物液,精氨酸酰胺酶,65,操作方法标本准备以清洁塑料容器盛精液标本，液化标本室温可置3h，勿冷冻保存按每管参加反应的精子数为7.5106个，根据标本精子浓度(M106/ml)，计算实验所需精液量v ml（计算方法：v=7.5/M）试剂准备反应液临用前配制底物缓冲液14,66,操作方法,67,结果计算单位定义在24，水解1.0molBAPNAmin的底物量定义为1IU顶体酶活性计算顶体酶活性(IU/106精子) 106正常参考值 48.2218.7 IU/106精子,495 7.5,（测定管OD值 空白管OD值） 2,68,检测意义升高前列腺肥大或早期前列腺癌降低前列腺炎试验原理对硝基酚磷酸盐对硝基酚黄色化合物，其显色程度于405nm波长与标本酸性磷酸酶浓度成正比,五 、精浆酸性磷酸酶的检测,精浆酸性磷酸酶,加酸,加碱,69,标本准备记录受检者一次射精的精液总量(ml)。精液液化后不超过30分钟，以3000g离心10分钟，保留精浆若样本不能立即测定，于Eppendorf管中加50ul精浆和50ul ACP保存液，充分混匀。将精浆标本稀释5000倍,70,比色及计算ACP国际单位（IU）：1单位酸性磷酸酶=37下每分钟产生1umol PNP标本系数=总孵育体积样本体积反应时间(min)精浆稀释倍数标准管浓度对应的标本浓度值(U/ml) =标准管实际浓度1850010001/1.11=标准管实际浓度16.667,71,各标准管计算结果如下,72,报告方式标本最终检测结果以“精浆ACP总活性”方式报告，即总活性=标本浓度(U/ml)一次射精的精液体积(ml) =U/一次射精 参考值范围200 U/一次射精（WHO）暂定中国人正常参考值：500 U/一次射精,73,六、精浆柠檬酸的测定,正常人精浆柠檬酸含量10mg/一次射精功能：通过与钙的结合而调节精浆中钙离子的浓度，并影响射精后精液的液化功能参入维持精浆渗透压对精子活动及透明质酸酶的活性也起重要作用其含量与睾酮水平相关，可以帮助判断雄激素的分泌状况及评价前列腺的功能,7