生物化学实验教案(1).doc

生物化学实验生物化学实验 教案 侯沁文侯沁文 目目 录录 实验一实验一 糖的颜色反应糖的颜色反应 1 实验二实验二 糖的还原作用糖的还原作用 3 实验三实验三 多糖的实验多糖的实验 4 实验四实验四 糖的旋光性和变旋现象糖的旋光性和变旋现象 5 实验五实验五 血糖的定量测定 葡萄糖氧化酶法 血糖的定量测定 葡萄糖氧化酶法 7 实验六实验六 人血清中总胆固醇的测定人血清中总胆固醇的测定 8 实验七实验七 牛奶中粗脂肪含量的测定牛奶中粗脂肪含量的测定 9 实验八实验八 牛奶中牛奶中酪蛋白的提取酪蛋白的提取 11 实验九实验九 牛奶中酪蛋白含量的测定牛奶中酪蛋白含量的测定 12 实验十实验十 氨基酸的纸层析氨基酸的纸层析 14 实验十一实验十一 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 16 实验十二实验十二 蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应 18 实验十三实验十三 蛋白质的沉淀反应蛋白质的沉淀反应 20 实验十四实验十四 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量 21 实验十五实验十五 双缩脲法测定蛋白质浓度双缩脲法测定蛋白质浓度 22 实验十六实验十六 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 24 实验十七实验十七 紫外光吸收法测定蛋白质浓度紫外光吸收法测定蛋白质浓度 25 实验十八实验十八 血清谷丙转氨酶的测定血清谷丙转氨酶的测定 27 实验十九实验十九 过氧化物酶的作用过氧化物酶的作用 28 实验二十实验二十 溶菌酶的提纯结晶溶菌酶的提纯结晶 29 实验二十一实验二十一 酵母酵母 RNA 的提取的提取 30 实验二十二实验二十二 RNA 的定量测定 苔黑酚法 的定量测定 苔黑酚法 31 实验二十三实验二十三 DNA 的提取及含量测定的提取及含量测定 32 实验二十四实验二十四 荞麦中总黄酮的定性定量研究荞麦中总黄酮的定性定量研究 32 1 实验一 糖的颜色反应 实验目的及要求实验目的及要求 1 掌握莫式 Molisch 试验鉴定糖的原理和方法 2 掌握塞式 Seliwanoff 试验鉴定酮糖的原理和方法 3 掌握杜式 Tollen 试验鉴定酮糖的原理和方法 实验原理实验原理 1 莫式试验 糖经无机酸 浓硫酸 浓盐酸 脱水产生糠醛或糠醛衍生物 后者在浓无机酸 作用下 能与 萘酚生成紫红色缩合物 2 塞式试验 酮糖在浓酸的作用下 脱水生成 5 羟甲基糠醛 后者与间苯二酚作用 呈红色 反应 有时亦同时产生棕红色沉淀 此沉淀溶于乙醇 成鲜红色溶液 3 杜式试验 戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛 后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质 实验仪器及用品实验仪器及用品 仪器 水浴锅 器皿 吸管 试管 实验药品 蔗糖 葡萄糖 淀粉 果糖 阿拉伯糖 半乳糖 萘酚 浓硫酸 95 乙醇 间 苯二酚 盐酸 间苯三酚 实验试剂实验试剂 莫式试剂 萘酚 5g 溶于 95 乙醇并稀释至 100ml 现用现配 并贮于棕色试剂瓶中 塞式试剂 间苯二酚 50mg 溶于 100ml 盐酸 VH2O VHCl 2 1 现用现配 杜式试剂 2 间苯三酚乙醇溶液 2g 间苯三酚溶于 100ml95 乙醇中 3ml 缓缓加入浓盐酸 15ml 及蒸馏水 9ml 临用时配制 实验内容及步骤实验内容及步骤 一 莫式实验 于 4 支试管中 分别加入 1 ml1 葡萄糖溶液 1 蔗糖溶液 1 淀粉溶液和少许纤维素 棉花 或滤纸浸在 1 ml 水中 然后各加莫式试剂 2 滴 摇匀 将试管倾斜 沿管壁慢慢加入浓硫酸 1 5 ml 切勿振摇 硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层 观察液面交界处有无紫色环出现 二 塞式试验 于 4 支试管中 分别加入 0 5 ml1 葡萄糖溶液 1 蔗糖溶液 1 果糖溶液 然后各加塞式试 剂 2 5ml 摇匀 同时置沸水浴内 比较各管颜色及红色出现的先后顺序 三 杜式试验 2 于 3 支试管中加入杜式试剂 1ml 再分别加入 1 滴 1 葡萄糖溶液 1 半乳糖溶液和 1 阿拉 伯糖溶液 混匀 将试管同时放入沸水浴中 观察颜色的变化 并记录颜色变化的时间 四 实验现象记录 仔细观察实验中的颜色变化 对于塞式试验和杜式试验还需记录下颜色变化的时间 3 实验二 糖的还原作用 实验目的及要求实验目的及要求 掌握糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法 实验原理实验原理 费林 Fehling 试剂和本尼迪 Benedict 试剂均为含 Cu2 的碱性溶液 能使具有自由醛基或酮基 的糖氧化 其本身则被还原成红色或黄色的 Cu2O 此法常用作还原糖的定性或定量测定 实验仪器及用品实验仪器及用品 实验仪器 水浴锅 实验器皿 吸管 试管 实验试剂 硫酸酮 氢氧化钠 酒石酸钾钠 柠檬酸钠 无水碳酸钠 淀粉 蔗糖 葡萄糖 实验试剂实验试剂 1 费林试剂 试剂 A CuSO4 5H2O 34 5 g 溶于蒸馏水并稀释至 500 ml 试剂 B 氢氧化钠 125 g 酒石酸钾钠 137 g 溶于蒸馏水并稀释至 500 ml 临用时将试剂 A 与试剂 B 等体积混合 2 本尼迪试剂 柠檬酸钠 Na3C6H3O7 11H2O 及 50 g 无水碳酸钠 溶于 400 ml 蒸馏水中 另溶解 8 5 g 硫酸铜于 50 ml 热水中 将硫酸铜溶液缓缓加入柠檬酸钠 碳酸钠溶液中 边加边搅拌 如有沉淀可过滤 此混合液可长期使用 实验内容及步骤 于 3 支试管中加入费林试剂 A 和 B 各 1 ml 混匀 分别加入 1 葡萄糖溶液 1 蔗糖溶液和 1 淀 粉溶液 1 ml 置沸水浴中加热数分钟 取出 冷却 观察各管的变化 另取 3 支试管 分别加入 1 葡萄糖溶液 1 蔗糖溶液和 1 淀粉溶液 1 ml 然后每支试管加 本尼迪试剂 2 ml 置沸水浴中加热数分钟 取出 冷却 和上面结果比较 4 实验三 多糖的实验 实验目的及要求实验目的及要求 1 熟悉淀粉多糖的碘试验反应原理和方法 2 进一步了解淀粉的水解过程 实验原理实验原理 淀粉广泛分布于植物界 谷 果实 种子 块茎中含量丰富 工业用的淀粉主要来源于玉米 山芋 马铃薯 本实验以马铃薯为原料 利用淀粉不溶或难溶于水的性质来制备淀粉 淀粉遇碘呈蓝色 是由于碘被吸附在淀粉上 形成复合物 此复合物不稳定 极易被醇 氢 氧化钠和加热等使颜色褪去 其他多糖与碘呈特异的颜色 此类呈色物质极不稳定 淀粉在酸催化下加热 逐步水解成分子较小的糖 最后水解成葡萄糖 实验仪器及用品实验仪器及用品 器材 研钵 布氏漏斗 抽滤瓶 表面皿 白瓷板 胶头滴管 电炉 石棉网 纱布 试管 烧杯 吸管 量筒 试管夹 试剂 碘化钾 碘 淀粉 氢氧化钠 本尼迪试剂 浓硫酸 碳酸钠 实验内容及步骤实验内容及步骤 一 马铃薯淀粉的制备 将马铃薯去皮 在研钵中充分研碎 加水混合 用纱布过滤 除去粗颗粒 滤液中的淀粉很 快沉到底部 多次用水洗淀粉 抽滤 滤饼放在表面皿上 在空气干燥中即得 二 淀粉与碘的反应 1 置少量自制淀粉于白瓷板上 加 1 3 滴稀碘液 配制 2 碘化钾溶液 加入适量碘 使溶液 呈淡黄棕色即可 观察颜色变化 2 取试管 1 支 加 0 1 淀粉 5 ml 再加 2 滴稀碘液 摇匀后 观察其颜色变化 将管内液体 分成 3 份 其中 1 份加热 观察颜色是否褪去 冷却后 颜色是否全部恢复 另 2 份加入乙醇或 10 NaOH 溶液 观察颜色变化并解释之 三 淀粉的水解反应 在一小烧杯中加入 1 淀粉溶液 25 ml 及 20 硫酸 1 ml 放在石棉网上小火加热 微沸后每隔 两分钟取出反应液 2 滴置于白瓷板上做碘试验 与此同时另取反应液三滴 用 10 碳酸钠中和后 做本尼迪试验 记录试验结果并解释之 5 实验四 糖的旋光性和变旋现象 实验目的及要求实验目的及要求 1 了解糖的变旋现象 掌握用糖的旋光性测定糖浓度的方法 2 学会使用旋光仪 实验原理实验原理 光是一种电磁波 光波振动的方向与光的前进方向垂直 普通光的光波在各个不同的方向上振 动 但如果让它通过一个尼科尔 Nicol 棱镜 用冰洲石制成的棱镜 则透过棱镜的光就只在一个 方向 偏振面 上振动 这种光就叫做平面偏振光 偏振光能完全通过晶轴与其偏振面平行的尼科 尔棱镜 而不能通过晶轴与其偏振面垂直的尼科尔棱镜 当平面偏振光通过某种介质时 有的介质对偏振光没有作用 即透过介质的偏振光的偏振面保 持不变 而有的介质却能使偏振光的偏振面发生旋转 这种能旋转偏振光的偏振面的性质叫做旋光 性 具有旋光性的物质叫做旋光性物质或光活性物质 具有不对称结构的手性化合物都有旋光性 6 能使偏振光的偏振面向右旋的物质 叫做右旋物质 反之 叫做左旋物质 通常用 d 拉丁 文 dextro 的缩写 右 的意思 或 表示右旋 用 l 拉丁文 laevo 的缩写 左 的意思 或 表 示左旋 偏振光的偏振面被旋光物质所旋转的角度 叫做旋光度 用 表示 旋光度的大小不仅取决于物质的本性 还与溶液的浓度 液层的厚度 光的波长 测定温度 以及溶剂的性质等等有关 偏振光通过厚度为 1dm 浓度含有 1g ml 的待测物质的溶液所测得的旋光度称为比旋光度 它是物质的一个特性常数 如下式所示 t cl 式中 t 测定时的温度 测定时所用光源的波长 实测的旋光度 c 溶液的浓度 g ml l 玻管的长度 dm 一个有旋光性的溶液放置后其比旋光度改变的现象称为变旋 变旋的原因是糖从 型变为 型或由 型变为 型 一切单糖都有变旋现象 无 型的糖类即无变旋性 实验仪器及用品实验仪器及用品 仪器 旋光仪 电子天平 器皿 容量瓶 烧杯 玻棒 试剂 未知浓度的蔗糖溶液 10 葡萄糖溶液 实验内容及步骤实验内容及步骤 一 利用糖的旋光性测定糖的浓度 1 转开样品管螺母 洗净玻管 然后向管中注满蒸馏水 盖上玻片 注意管中不能有气泡 玻片上的水渍必须擦干 2 把样品放入旋光仪内 打开电源 待钠光源稳定 1 2min 后 转动刻度盘 使目镜中两半圆 的亮度相等 记下刻度盘的读书 以此为零点 3 用蔗糖代替蒸馏水测其旋光度 并按公式计算出蔗糖的浓度 二 糖的变旋现象 用新配制的 10 葡萄糖溶液按上法测其旋光度并计算比旋光度 以后每隔 2h 测定其旋光度 计算比旋光度直至比旋光度不再改变 说明 型互变已达平衡 7 实验五 血糖的定量测定 葡萄糖氧化酶法 实验目的及要求实验目的及要求 掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的原理和方法 实验原理实验原理 D 葡糖糖 D 葡萄糖酸 H2O2 实验仪器及试剂实验仪器及试剂 试管 移液管 UNICO 2000 型分光光度计 恒温水浴锅 酶试剂 葡萄糖氧化酶 GOD 过氧化物酶 POD 4 氨基安替吡啉 4 AAP 酚试剂 苯酚 标准葡萄糖溶液 100 mg dL 5 55 mmol L 实验步骤实验步骤 按下表加入各反应物 加入物 ml 空白管标准管测定管 葡萄糖标准液 0 020 血清样品 0 020 酶试剂1 501 501 50 酚试剂1 501 501 50 混匀 37 保温 15min 以空白管调零 505nm 波长处测定各管吸光度值 计算 血糖含量 A样 A标 标准溶液浓度 实验注意事项实验注意事项 1 分离血清要求使用未溶血样品 否则测定结果偏大 2 要求在 30 min 内分离血清 糖酵解在全血中以 7 h 进行 3 样本在 4 8 可稳定 24h 样本放置时间过长会使结果偏低 GOD POD H2O2 4 AAP 苯 酚 红色醌化物 H2O 8 实验六 人血清中总胆固醇的测定 实验目的及要求实验目的及要求 学会利用氧化酶法测定血清中总胆固醇含量的原理和方法 实验原理实验原理 胆固醇脂 H2O 胆固醇 游离脂肪酸 胆固醇 O2 4 胆甾烯酮 H2O2 2H2O2 4 AA 4 氯仿 醌亚胺 红色 4H2O CEH 胆固醇脂酶 POD 过氧化物酶 CHOD 胆固醇氧化酶 4 AA 4 氨基安替吡啉 醌亚胺在 500nm 有特征吸收 且生成量与样本中的胆固醇含量成正比 可通过测定标准品反 应生成的醌亚胺的吸光度值 计算出样本中胆固醇的浓度 实验仪器及试剂实验仪器及试剂 试管 移液管 UNICO 2000 型分光光度计 恒温水浴锅 标准血清 样本血清 蒸馏水 酶试剂盒 实验步骤实验步骤 按下表加入各反应物 l空白管标准管样本管 酶试剂200020002000 蒸馏水20 标准血清 20 样本血清 20 A500nm 各管混匀 37 反应 6 min 以空白管校零 CEH CHOD POD A样 本 A标 准 标准血清浓度 胆固醇含量 9 实验七 牛奶中粗脂肪含量的测定 实验目的及要求实验目的及要求 学习和掌握粗脂肪的定量测定法 索氏提取法 实验原理实验原理 本实验用重量法 利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性 用脂溶性溶剂将脂肪提取出来 借蒸发除去溶剂后称量 整个 提取过程均在索氏提取器中进行 通常使用的脂溶性溶剂为乙 醚或沸点为 30 C 60 C 的石油醚 用此法提取的脂溶性物质除 脂肪外 还含有游离脂肪酸 磷脂 固醇 芳香油及某些色素 等 故称为 粗脂肪 索氏提取器 如图所示 利用溶剂回流及虹吸原理 使固体 物质连续不断地被纯溶剂萃取 既节约溶利萃取效率又高 萃 取前先将固体物质研碎 以增加固液接触的面积 然后将固体 物质放在滤纸套内 置于提取器中 提取器的下端与盛有溶剂的圆底烧瓶相连 上面接回流冷凝管 加热圆底烧瓶 使溶剂沸腾 蒸气通过提取器的支管上升 被冷凝后滴入提取器中 溶剂和固体接 触进行萃取 当溶剂面超过虹吸管的最高处时 含有萃取物的溶剂虹吸回烧瓶 因而萃取出一部分 物质 如此重复 使固体物质不断为纯的溶剂所萃取 将萃取出的物质富集在烧瓶中 实验仪器及试剂实验仪器及试剂 索氏提取器 干燥箱 电子分析天平 滤纸 棉线 干燥器 烘箱 全脂牛奶 无水乙醚或石油醚 实验内容及步骤实验内容及步骤 1 牛奶中水分含量的测定 准确称取一定量牛奶 吸附于70 过夜烘干的层析滤纸上 70 烘干后 约20分钟 称量 计 算水分含量 水分含量 M牛奶 M干物质 M牛奶 100 M干物质 M带有干物质的层析滤纸 M层析滤纸 2 牛奶中粗脂肪含量的测定 将洗净的索氏提取器小烧瓶用铅笔在磨口处编号 103 105 烘干2小时 取出 置于干燥器中 冷却 然后用电子分析天平称重 并记录 将测完水分含量带有干物质的层析滤纸用定性滤纸包裹 称量后置索氏抽提瓶 连接已干燥至恒重的脂肪接受瓶 由冷凝管上端加入无水乙醚 加量为接受 瓶的2 3体积 恒温水浴加热 控制水温 以每小时回流3 5次为宜至抽提完全为止 用滤纸试 10 取下接受瓶 在水浴上蒸干乙醚 再于100 105 干燥 2小时 取出放干燥器内冷却30分钟 称 重 重复操作至恒重 取出滤纸包 于户外晾至无乙醚味 置入恒温箱内 烘干 然后移入干燥缸 内冷却后称重 重复操作至恒重 计算 1 粗脂肪含量 M提取前纸包 M提取后纸包 M干物质 100 2 粗脂肪含量 M接受瓶 粗脂肪 M接受瓶 M干物质 100 注意事项注意事项 1 乙醚为易燃有机溶剂 实验室应保持通风并禁止任何明火 2 抽提用的乙醚或石油醚要求无水 无醇 无过氧化物 挥发残渣含量低 因水和醇可导致 水溶性物质溶解 如水溶性盐类 糖类等 使得测定结果偏高 被测样品也要事先烘干 过氧化物 会导致脂肪氧化 在烘干时也有引起爆炸的危险 3 装样品的滤纸筒一定要严密 不能往外漏样品 但也不要包得太紧影响溶剂渗透 放入滤 纸筒时高度不要超过回流弯管 否则超过弯管的样品中的脂肪不能提尽 造成误差 11 实验八 牛奶中酪蛋白的提取 实验目的及要求实验目的及要求 掌握一种提取酪蛋白及检测牛乳质量的方法 实验原理实验原理 酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质 占乳蛋白的 80 82 酪蛋白不是单一的蛋白质 是一类含磷的复合蛋白质混合物 以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合 它还含有胱氨酸 和蛋氨酸这两种含硫氨基酸 但不含半胱氨酸 它在牛乳中的含量约为 35g L 比较稳定 利用这 一性质可以检测牛乳中是否掺假 酪蛋白在其等电点 pH4 6 时由于静电荷为零 溶解度很低 利用这一性质 将牛乳调到 pH4 6 酪蛋白就可从牛乳中分离出来 酪蛋白不溶于乙醇 这个性质被用来从酪蛋白粗制品中将 脂类杂质除去 实验仪器及用品实验仪器及用品 温度计 布氏漏斗 pH 试纸 抽滤瓶 水浴锅 烧杯 量筒 表面皿 天平 离心机 市售全脂牛奶 无水乙醇 无水乙醚 pH4 7 乙酸钠缓冲液 0 2mol L 实验内容及步骤实验内容及步骤 1 酪蛋白等电点沉淀 将 100mL 牛乳放到 500mL 烧杯中 加热到 40 加入到同样 40 的乙酸钠缓冲液中 调到 pH4 7 此时有絮状的蛋白质沉淀析出 将悬浮液冷却至室温 放置分层 3000 r min 离心 15 min 收集沉淀 2 水洗 将 pH4 7 醋酸 醋酸钠缓冲溶液用蒸馏水稀释 10 倍 洗涤粗制品三次 离心 10 分钟 得到沉 淀蛋白 3 去脂 向粗制品中加入 10 ml 无水乙醇 搅拌片刻 将全部悬浊液转移至布氏漏斗中 用乙醚 乙醇混 合液洗涤沉淀两次 最后用乙醚洗沉淀 2 次 抽干 将沉淀从布氏漏斗中移去 在表面皿上摊开除 去乙醚 干燥后得到的是酪蛋白纯品 准确称重后 计算出每 100mL 牛 乳所制备出的酪蛋白质量 g 100 mL 并与理论产量 3 5g 100mL 相比较 求出实际获得百分率 12 实验九 牛奶中酪蛋白含量的测定 实验目的及要求实验目的及要求 1 学会用紫外吸收光谱法测定核酸蛋白混合物中蛋白质含量的方法 2 掌握 A224 0nm A233 3nm测定蛋白含量的原理和方法 实验原理实验原理 蛋白质中含有酪氨酸 色氨酸等芳香族氨基酸 在紫外光 280nm 波长处有最大吸收 核酸及 其衍生物有吸收紫外线的性质 其最高吸收峰在 260nm 处 由于核酸在 280nm 处也有光吸收 因 此当蛋白质和核酸共同存在时 测定其中任何一种物质均存在干扰 核酸在 230nm 波长附近吸收 值极小 如果将核酸测定值以 230nm 为中心 两侧存在对称而又相等的等吸收点 224nm 波长处 的吸收值和 233 3nm 波长处的吸收值相等 蛋白质则不同 从 240nm 波长处向短波长处移动时 其吸收值对波长的减小吸收值呈线性增加 因此 在 240nm 以下短波长一侧的核酸等吸收点中 如果测定蛋白质和核酸混合光密度值 两点间的光密度之差和蛋白质成比例关系 该方法是格罗夫 斯等 1968 年建立起来的 能够对浓度为 5 180 微克 毫升的样品作微量测定 该方法有快速 灵敏 不破坏样品原有性质的优点 在测定完蛋白质含量后可用于其他分析 实验仪器及试剂实验仪器及试剂 试管 移液管 容量瓶 烧杯 玻璃棒 UNICO 2000 型分光光度计 pH7 磷酸缓冲液 13 实验内容及步骤实验内容及步骤 用 pH7 的磷酸缓冲液溶解上次实验制得的酪蛋白 配置成 5 180 g ml 的溶液 测定其在 224 nm 波长处和 233 3 nm 波长处的光密度值 按公式 C蛋白质 mg ml A224 A233 3 210 计算浓度并 反推回至每 100 ml 牛奶中的蛋白含量 注意事项注意事项 1 在用紫外吸收光谱定量测定蛋白质时 280nm 波长处蛋白质吸收光谱主要由色氨酸和酪氨 酸引起 但在 224 240nm 波长处的紫外吸收谱不仅由这些氨基酸引起 与苯丙氨酸 组氨酸 蛋氨 酸 胱氨酸及半胱氨酸也有关 因此与其他吸收紫外线的不纯物质共同存在时 就会受到显著影响 这一点也应引起注意 2 pH 值对核酸测定的等吸收点有影响 14 实验十 氨基酸的纸层析 实验目的及要求实验目的及要求 了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法 实验原理实验原理 用滤纸为支持物进行层析的方法 称为纸层析法 纸层析所用的展层溶剂大多由水和有机溶 剂组成 滤纸纤维与水的亲和力弱 因此在展层时 水是固定相 有机溶剂是流动相 溶剂由下向 上移动的 称为上行法 由上向下的 称下行法 将样品点在滤纸上 进行展层 样品中的各种氨 基酸在两相溶剂中不断进行分配 由于它们的分配系数不同 不同氨基酸随流动相移动的速率就不 同 形成距原点距离不等的层析点 于是便将这些氨基酸分离开来 溶质在滤纸上的移动速率用 Rf表示 Rf 原点到层析点中心的距离 原点到溶剂前沿的距离 只要条件不变 Rf是常数 故可根据 Rf值作定性依据 实验仪器及用品实验仪器及用品 实验器材 滤纸 烧杯 剪刀 层析缸 微量注射器 10 l 电吹风 722 型分光光度计 实验试剂 氨基酸混合液 碱相熔剂 V正丁醇 V12 氨水 V95 乙醇 13 3 3 酸相溶剂 V正丁醇 V80 甲酸 V水 15 3 2 显色贮备液 V0 4mol L 茚三酮 异戊醇 V甲酸 V水 20 1 5 实验内容及步骤实验内容及步骤 一 标准氨基酸单向上行层析法 1 滤纸准备 2 点样 3 展层和显色 二 混合氨基酸双向上行纸层析 1 准备 2 点样 3 展层和显色 4 定性鉴定与定量测量 三 数据记录和处理 15 1 计算出每种标准氨基酸的 Rf值 2 混合氨基酸的 Rf值 3 对照标准氨基酸的 Rf值 指出氨基酸的名称 实验注意事项实验注意事项 必须选用新华 1 号滤纸 点样时 样点的直径不能超出 0 5mm 16 实验十一 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 实验目的实验目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作 了解电泳技术的一般原理 实验原理实验原理 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法 带电物质在电场力作用下 向 着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳 由于各种蛋白质都有特定的等电点 如将蛋白质置于 pH 值低于其等电点的溶液中 则蛋白质将带正电荷而向负极移动 反之 则向正极移动 因为蛋 白质分子在电场中移动的速度与其带电量 分子的形状及大小有关 所以 可用电泳法将不同的蛋 白质分离开来 血清中含有多种蛋白质 它们的等电点都在 pH 7 5 以下 将血清置于 pH 8 6 的缓 冲液电泳时 所有的血清蛋白都带有负电荷 在电场中将向正极移动 由于各种血清蛋白在相同 pH 时所带电荷数量不等 分子颗粒大小不一 因而泳动速度不同 经电泳被分离开来 血清蛋白 质的等电点和分子量见下表 蛋白质名称等电点 pI 相对分子质量 清蛋白4 8869 000 1 球蛋白5 00200 000 2 球蛋白5 06300 000 球蛋白5 129 000 150 000 球蛋白6 85 7 50156 000 300 000 本实验以醋酸纤维素薄膜 简称 CAM 为支持物分离血清中的不同蛋白质 它是一种良好的 呈均一泡沫状疏松薄膜 厚约 120 m 具有一定的吸水性 实验材料 仪器及试剂实验材料 仪器及试剂 1 材料 健康人血清或鸡血清 2 仪器 电泳仪 电泳槽 3 试剂 1 醋酸纤维素薄膜 2 pH8 6 巴比妥缓冲液 离子强度 0 06 0 07 取巴比妥 0 83 克 巴比妥钠 6 38 克 加 蒸馏水加热溶解后 定容至 500ml 17 3 染色液 取氨基黑 10 B 0 5 克 溶于 50ml 甲醇中 再加冰醋酸 10ml 蒸馏水 40ml 混匀 4 漂洗液 95 乙醇 4 5ml 冰醋酸 5ml 蒸馏水 50ml 混合 5 透明液 95 乙醇 80ml 冰醋酸 20ml 混合 实验方法实验方法 1 准备薄膜 将切割整齐的 2 5 6cm 的薄膜条 浸入巴比妥缓冲液中浸透后 取出 用吸水 纸吸去多余缓冲液 2 点样 仔细辩认薄膜的粗糙面与光滑面 在粗糙面距离薄膜一端 1 5cm 处 用铅笔轻轻划 一条直线 用玻棒蘸上血清样品 涂于盖玻片边缘处 边缘长度应比膜条宽度窄 将此边缘按压 在直线上 注意 样品应点在薄膜的粗糙面一侧 待血清完全渗入薄膜后 将膜面翻转 点样面 粗糙面 朝下 置电泳槽中 薄膜点样端放于负极一侧 3 电泳 打开电源 调节电压 110 130V 电流 0 4 0 6m A cm 宽 电泳时间 45 60 分钟 电泳完毕后 关闭电源 4 染色漂洗 将薄膜从电泳槽中取出 直接浸入染色液中约 5 分钟 再转入漂洗液中反复浸 洗 3 4 次 直至背景颜色脱净为止 此时 正常血清蛋白在薄膜上显示出五条区带 从前端至点 样处的方向分别为清蛋白 1 球蛋白 2 球蛋白 球蛋白及 球蛋白 5 定量测定 将膜条用滤纸压平吸干 按区带分段剪开 分别浸在体积 0 4mol L 氢氧化钠溶 液中 并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照 进行比色 或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明 液中浸泡 2 3 分钟后 取出贴于洁净玻璃板上 干燥后 即为透明薄膜图谱 可用光密度计直接 测定 注意事项注意事项 1 点样好坏是电泳图谱是否清晰的关键 点样量要适当 2 漂洗时应多漂洗几次 直至无蛋白区底色脱净为止 18 实验十二 蛋白质的颜色反应 实验目的及要求实验目的及要求 掌握鉴定蛋白质的原理和方法 实验原理实验原理 蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用 可产生特定的颜色反应 不同蛋白质所含氨基 酸不完全相同 颜色反应亦不同 颜色反应不是蛋白质的专一反应 一些非蛋白质物质亦可产生相 同颜色反应 因此不能仅根据颜色反应的结果来决定被测物是否是蛋白质 颜色反应是一些常用蛋 白质定量测定的依据 双缩脲反应 将尿素加热 两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲 双缩脲在碱性环境中 能 与硫酸铜结合成红紫色的络合物 此反应称为双缩脲反应 蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似 故能呈此反应 黄色反应 蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸 如酪氨酸 色氨酸等 遇硝酸可硝化成黄 色物质 此物质在碱性环境中变为黄色的硝苯衍生物 茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热 则产生蓝紫色的还原茚三酮 茚三酮和氨的缩合物 此反 应为一切蛋白质及 氨基酸所共有 含氨基酸的其他物质亦呈此反应 实验仪器及用品实验仪器及用品 实验器材 鸡蛋白 吸管 滴管 试管 水浴锅 电炉 实验试剂 卵清蛋白 0 1 茚三酮 尿素 10 NaOH 浓硝酸 1 硫酸铜溶液 实验内容及步骤实验内容及步骤 1 双缩脲反应 1 取少许结晶尿素放在干燥试管中 微火加热 尿素熔化并形成双缩脲 释出的氨可用红 色石蕊试纸试之 至试管内有白色固体出现 停止加热 冷却 然后加 10 NaOH 溶液 1ml 摇匀 再加 2 滴 1 CuSO4溶液 混匀 观察有无紫色出现 2 另取一支试管 加蛋白质溶液 10 滴 再加 10 NaOH 溶液 10 滴及 1 CuSO4溶液 2 滴 混匀 观察是否出现紫玫瑰色 2 黄色反应 19 于一试管内 加入蛋白质溶液 10 滴及浓硝酸 3 4 滴 加热 冷却后再加 10 NaOH 溶液 5 滴 观察颜色变化 3 茚三酮反应 取 1ml 蛋白质溶液置于烧杯中 加 2 滴茚三酮试剂 加热至沸 即有蓝紫色出现 实验注意事项实验注意事项 1 在双缩脲反应中 硫酸铜不能多加 2 茚三酮反应需在 pH5 7 下进行 20 实验十三 蛋白质的沉淀反应 实验目的及要求实验目的及要求 1 熟悉蛋白质的沉淀反应 2 进一步掌握蛋白质的相关性质 实验原理实验原理 多数蛋白质是亲水胶体 当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后 即产生沉淀 蛋白质盐析作用 向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度 蛋白质即沉淀析出 这种作用称为 盐析 乙醇沉淀蛋白质 乙醇为脱水剂 能破坏蛋白质质点的水化层使其沉淀出来 重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质与重金属离子结合成不溶性盐类而沉淀 实验仪器及用品实验仪器及用品 实验器材 试管 吸管 吸滤瓶 布式漏斗 实验试剂 蛋白质试液 硫酸铵结晶体 饱和硫酸铵溶液 95 乙醇 结晶氯化钠 1 醋酸 铅 5 鞣酸溶液 1 硫酸铜溶液 饱和苦味酸溶液 1 醋酸溶液 实验内容及步骤实验内容及步骤 一 蛋白质盐析作用 1 取蛋白质溶液 5ml 加入等量饱和硫酸铵溶液 微微摇动试管 使溶液混合静置几分钟 球 蛋白即析出 2 将上述混合液过滤 滤液中加硫酸铵粉末 至不再溶解 析出的即为清蛋白 再加水稀释 观察是否溶解 二 乙醇沉淀蛋白质 取蛋白质溶液 1ml 加晶体 NaCl 少许 待溶解后再加入 95 乙醇 2ml 混匀 观察有无沉淀析 出 三 重金属盐沉淀蛋白质 取试管 2 支 各加蛋白质 2ml 一管内滴加 1 醋酸铅溶液 另一管内滴加 1 CuSO4 溶液 至 有沉淀生成 21 四 生物碱试剂沉淀蛋白质 取 2 支试管各加 2ml 蛋白质溶液及 1 醋酸溶液 4 5 滴 向一管中加 5 鞣酸溶液数滴 另一管 内加饱和苦味酸溶液数滴 观察结果 实验十四 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定 蛋白质相对分子质量 实验目的及要求实验目的及要求 了解 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法的原理 并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子质量 实验原理实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开 是由于这些大分子化合物所带电荷 的差异和分子大小不同之故 如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度 这些化 合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量 SDS 是一种阴离子去污剂 它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物 其负电荷 远远超过了蛋白质分子原有的电荷 也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别 这样就使 电泳迁移率只取决于分子大小这一因素 就可根据标准蛋白质的相对分子质量的对数对迁移率所作 的标准曲线来求得未知蛋白质的相对分子质量 实验仪器及用品实验仪器及用品 实验器材 直流稳压电泳仪 垂直平板电泳槽 移液器 微量注射器 烧杯 试管 滴管 直尺 实验试剂 凝胶贮备液 分离胶缓冲液 浓缩胶缓冲液 10 SDS 样品缓冲液 电极缓冲液 10 过硫酸铵 1 5 琼脂 染色液 脱色液 待测分子质量的样品 实验内容及步骤实验内容及步骤 1 装配电泳槽 2 分离胶的选择和配制 3 分离胶的灌制 4 浓缩胶的配制和灌注 5 样品的制备 1 标准蛋白质样品的制备 22 2 待测蛋白质样品的制备 6 电泳 7 染色与脱色 8 相对分子质量的计算 9 数据记录和处理 以标准蛋白质相对分子量的对数对相对迁移率作图 得到标准曲线 根 据待测蛋白质样品的相对迁移率 从标准曲线上查出其相对分子质量 实验十五实验十五 双缩脲法测定蛋白质浓度双缩脲法测定蛋白质浓度 实验目的及要求实验目的及要求 了解并掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法 实验原理实验原理 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应 在碱性溶液中蛋白质与铜离子形成紫色配 合物 在 540nm 处有最大吸收 在一定浓度的范围内 蛋白质和浓度与双缩脲反应所呈的颜色深 浅成正比 可用比色法定量测定 实验仪器及用品实验仪器及用品 实验器材 容量瓶 试管 吸管 722 型 或 7220 型 分光光度计 实验试剂 1 双缩脲试剂 0 175g CuSO4 5H2O 溶于约 15 ml 蒸馏水 置于 100 ml 容量瓶中 加入 30 ml 浓氨水 30 ml 冰冷的蒸馏水和 20 ml 饱和 NaOH 溶液 摇匀 室温放置 2h 再加蒸馏水至刻度 摇匀备用 2 牛血清白蛋白 2 mg ml 溶液 3 未知浓度蛋白样品 实验内容及步骤实验内容及步骤 一 标准曲线的绘制 将 6 只 10 ml 容量瓶编号 按下表加入试剂 即得 6 种不同浓度的蛋白质溶液 瓶号牛血清白蛋白 2mg ml 溶 液 ml 蒸馏水蛋白质浓度 mg ml 11 0稀释至刻度0 2 22 0稀释至刻度0 4 33 0稀释至刻度0 6 44 0稀释至刻度0 8 55 0稀释至刻度1 0 66 0稀释至刻度1 2 23 取干净试管 7 只 按 0 1 2 3 4 5 6 编号 1 6 号管分别加入上述不同浓度的蛋白质液 3 0ml 0 号为对照管 加入 3 0ml 蒸馏水 各管加入双缩脲试剂 2 0ml 充分混匀 即有紫色出现 用 540nm 光测定各管吸光度 绘制浓度 吸光度曲线 二 样液的测定 取未知浓度的蛋白质溶液 3 0ml 置试管内 加入双缩脲试剂 2 0ml 混匀 测其 540nm 吸光度 三 数据记录和处理 根据标准溶液的吸光度 在坐标纸上绘制出浓度 吸光度曲线 测出未知液的吸光度后 在标 准曲线上查出未知液的浓度 24 实验十六 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 实验目的及要求实验目的及要求 学会用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 实验原理实验原理 考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合 这种结合具有高敏感性 考马斯亮蓝 G250 的磷酸 溶液呈棕红色 最大吸收峰在 465nm 当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色 其最大吸收峰改变 为 595nm 考马斯亮蓝 G250 蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度 在一定范围内 考马斯亮蓝 G250 蛋白质复合物呈色后 在 595nm 下 吸光度与蛋白质含量 呈线性关系 故可用于蛋白质浓度的测定 实验仪器及用品实验仪器及用品 实验器材 旋涡混合器 试管 吸管 722 型分光光度计 容量瓶 量筒 电子分析天平 实验试剂 1 0 9 NaCl 2 标准蛋白液 牛血清白蛋白 0 1 mg ml 3 染液 考 马斯亮蓝 G250 0 01 称取 0 1g 考马斯亮蓝 G250 溶于 50ml95 乙醇中 再加入 100 ml 浓磷 酸 加蒸馏水定容到 1000 ml 4 样品液 取牛血清白蛋白 0 1 mg ml 溶液 用 0 9 NaCl 稀 释至一定浓度 实验内容及步骤实验内容及步骤 一 标准曲线的绘制 取 7 支干净试管 按下表进行编号并加入试剂 试剂 1234567 标准蛋白液 ml00 10 20 30 40 60 8 0 9 NaCl ml1 00 90 80 70 60 40 2 考马斯亮蓝染液 ml4 04 04 04 04 04 04 0 蛋白质浓度 ug ml 0102030406080 A595 25 混匀 室温静置 3 min 以第一管为空白 于波长 595nm 处比色 读取吸光度 二 样液的测定 另取一干净试管 加入样品 1 0 ml 及考马斯亮蓝染液 4 0 ml 混匀 室温静置 3min 于波长 595nm 处比色 读取吸光度 三 数据记录和处理 根据标准溶液的吸光度 在坐标纸上绘制出浓度 吸光度曲线 测出未知液的吸光度后 在标 准曲线上查出未知液的浓度 实验十七 紫外光吸收法测定蛋白质浓度 实验目的及要求实验目的及要求 1 了解紫外光吸收法测定蛋白质浓度的原理 2 熟悉紫外分光光度计的使用 实验原理实验原理 蛋白质组成中含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸 在紫外光 280nm 波长处有最大吸收峰 一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比 故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质浓度 由于核酸在 280nm 波长处也有光吸收 对蛋白质测定有一定的干扰作用 但核酸的最大吸收 峰在 260nm 处 如同时测定 260nm 的光吸收 通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响 因此如 溶液中存在核酸时必须同时测定 280nm 及 260nm 的吸光度 方可计算测得溶液中的蛋白质浓度 实验仪器及用品实验仪器及用品 实验器材 UV 9100 型分光光度计 容量瓶 试管 吸管 实验试剂 卵清蛋白液 未知浓度蛋白质溶液 0 9 氯化钠 实验内容及步骤实验内容及步骤 一 直接测定法 在紫外分光光度计上 将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中 以生理盐水做对照 测得 280nm 和 260nm 两种波长的吸光度 代入下式计算蛋白质浓度 C 1 45A280nm 0 74A260nm 二 标准曲线法 1 标准曲线的绘制 取 8 支干净试管 编号 按下表加入试剂 01234567 1mg ml 卵清蛋白 液 mL 00 51 01 52 02 53 04 0 蒸馏水4 03053 02 52 01 51 00 26 蛋白质浓度 mg ml 00 1250 250 3750 50 6250 751 0 A280nm 加毕 混匀 用紫外分光光度计测 A280nm 以吸光度为纵坐标 蛋白质浓度为横坐标作图 2 未知样液的测定 取未知浓度的蛋白液 1 0ml 加蒸馏水 3 0mL 测 A280nm 对照标准曲线求得蛋白质浓度 三 数据记录和处理 1 直接测定法 做三组平行实验 取算术平均值 2 标准曲线法 用坐标纸绘制出标准曲线 根据未知液的吸光度从标准曲线中查出蛋白质浓度 27 实验十八 血清谷丙转氨酶的测定 实验目的及要求实验目的及要求 学会谷丙转氨酶 ALT 活力测定方法 实验原理实验原理 丙氨酸 酮戊二酸 丙氨酸氨基转移酶 L 谷氨酸 丙酮酸 2 4 二硝基苯胺 丙酮酸 2 4 二硝基苯腙 丙酮酸 2 4 二硝基苯腙在碱性溶液中呈现棕色 吸收峰为 520nm 实验步骤实验步骤 按下表顺序加入反应物 加入物 ml 空白管标准管测定管 样本 0 1 丙酮酸钠标准液 0 1 丙酮酸氨基转移酶基 质液 0 50 50 5 37 水浴保温 30min 2 4 二硝基苯肼溶液0 50 50 5 37 水浴保温 20min 碱性溶液5 05 05 0 10min 后测 A520 计算 ALT U L A样 A标准 95 U L 28 实验十九 过氧化物酶的作用 实验目的实验目的 了解过氧化物酶的作用 实验原理实验原理 过氧化物酶能催化过氧化氢释放出新生氧以氧化某些酚类和胺类物质 例如氧化溶于水的焦性 没食子酸生成不溶于水的焦性没食子橙 橙红色 氧化愈创木脂中的愈创木酸成为蓝色的愈创木 酸的臭氧化物 实验器材及试剂实验器材及试剂 白菜梗 棉花或纱布 吸管 胶头滴管 研钵 漏斗试管 电子天平 1 焦性没食子酸溶液 2 H2O2 白菜梗提取液 白菜梗约 5g 切成细块 置研钵内 加蒸馏水约 15ml 研磨成浆 经棉花或 纱布过滤 滤液备用 实验步骤实验步骤 取四支干净试管 按表标号并加入试剂 摇匀后 观察并记录各管颜色变化和沉淀的出现 管号 1 焦性没食 子酸 ml 2 H2O2 滴蒸馏水 ml 白菜梗提取 液 ml 煮沸的白菜梗 提取液 ml 1222 22 2 322 2 422 2 29 实验二十 溶菌酶的提纯结晶 目的要求目的要求 学习溶菌酶的提纯方法 实验原理实验原理 鸡蛋清内含有丰富的溶菌酶 向蛋清中加入一定量的中性盐 并调节 pH 至溶菌酶的等电区 溶菌酶即可结晶析出 如结晶不纯 可重结晶 器材与试剂器材与试剂 1 鸡蛋清 将新鲜鸡蛋两端各敲一小洞 使蛋清流出 蛋清的 pH 若低于 8 0 则不能使用 纱 布 烧杯 100ml 1 真空干燥器 25cm 1 2 氯化钠 应研细 3 五氧化二磷 工业品 做吸水使用 4 1mol L 氢氧化钠溶液 5 溶菌酶晶种 将无定形的溶菌酶配制成 5 水溶液 每 10ml 加入 NaCl 0 5g 滴加 1mol L NaOH 溶液调节 pH 至 9 5 10 0 置冰箱中 4 1 2 天内溶菌酶晶体即析出 吸滤取得晶体 用冷丙酮 0 以下 洗晶体 2 次 置放有五氧化二磷和石蜡的真空干燥器中干燥 操作步骤操作步骤 1 将两只鸡蛋的蛋清置于小烧杯中 蛋清 pH 不得低于 8 0 慢慢搅拌数分钟 使蛋清稠度 均匀 然后用两层纱布滤去卵带或碎蛋壳 量记蛋清体积 2 按 100ml 蛋清加 5g 氯化钠的比例 向蛋清内慢慢加入氯化钠细粉 边加边搅 使氯化钠 及时溶解 避免氯化钠沉于容器底部 否则将因局部盐浓度过高而产生大量白色沉淀 3 加完 NaCl 用 1mol L NaOH 调节 pH 至 9 5 10 0 边加边搅匀 避免局部过碱 加入少 量溶菌酶结晶作为晶种 4 放置数天 当肉眼观察有结晶形成后 吸取晶液一滴 置载玻片上 用显微镜观察 100 记录晶形 4 结晶用布氏漏斗滤得 用 0 丙酮洗涤数次 置真空干燥器干燥 30 实验二十一 酵母 RNA 的提取 实验目的实验目的 掌握稀碱法提取酵母 RNA 的原理和方法 实验原理实验原理 酵母核酸中 RNA 含量较多 DNA 则少于 2 RNA 可溶于碱性溶液 当碱被中和后 可加乙 醇使其沉淀 由此即可得到粗 RNA 制品 用碱液提取的 RNA 有不同程度的降解 器材与试剂器材与试剂 干酵母粉 市售 鲜酵母 市售 pH 试纸 电子天平 抽滤瓶 500ml 布氏漏斗 10cm 吸管 离心机 0 2 氢氧化钠溶液 2g NaOH 溶于蒸馏水并稀释至 1000ml 乙酸 95 乙醇 无水乙醚 氨水 10 硫酸溶液 浓硫酸 比重 1 84 10ml 缓缓倾于水中 稀释至 100ml 5 硝酸银溶液 5g AgNO3 溶于蒸馏水并稀释至 100ml 贮于棕色瓶中 苔黑酚 三氯化铁试剂 将 100mg 苔黑酚溶于 100ml 浓盐酸中 再加入 100mg FeCl3 6H2O 临用时配制 操作步骤操作步骤 1 RNA 的提取 称取 8g 干酵母粉于 100ml 烧杯中 加入 0 2 NaOH 溶液 40ml 沸水浴加热 30 分钟 经常 搅拌 冷却 加入乙酸数滴 使提取液呈酸性 pH5 6 用石蕊试纸试之 离心 10 15 分钟 4000r min 取上清液 加入 2 倍体积的 95 乙醇 边加边搅 加毕 静置 待完全沉淀 过 滤 滤渣先用 95 乙醇洗 2 次 每次约 10ml 继而用无水乙醚洗 2 次 每次 10ml 洗涤时可 用细玻璃棒小心搅动沉淀 乙醚滤干后 滤渣即为粗 RNA 可作鉴定和测定含量用 2 鉴定 31 取上述 RNA 约 0 5g 加 10 浓硫酸 5ml 加热至沸 1 2 分钟 将 RNA 水解 取水解液 0 5ml 加苔黑酚 三氯化铁试剂 1ml 加热至沸 1min 观察颜色变化 水解液 2ml 加氨水 2ml 及 5 硝酸银溶液 1ml 观察是否产生絮状的嘌呤银化合物 实验二十二 RNA 的定量测定 苔黑酚法 实验目的实验目的 掌握用苔黑酚法测定 RNA 含量的原理和方法 实验原理实验原理 在酸性条件下 RNA 分子中的核糖基转变成 呋喃甲醛 后者与苔黑酚作用生成绿色复合物 可用比色法测定 当核糖核酸浓度在 10 100 g ml 范围内 其浓度与吸光度呈线性关系 实验器材与试剂实验器材与试剂 1 粗制 RNA 上一个实验所得 试管 7 支 吸管若干 分光光度计 水浴锅 2 标准 RNA 母液 准确称取 RNA10 0mg 用少量蒸馏水溶解 如果不溶 可滴加浓氨水 调 pH7 0 定容至 10 0ml 此溶液浓度为 1mg ml 标准 RNA 溶液 取母液 1 0ml 置 10ml 容量瓶中 用蒸馏水稀释至刻度 此溶液为 100 gRNA ml 3 样品溶液 将一定量的 RNA 粗品用蒸馏水溶解并定容 RNA 浓度在 10 100 g ml 范围内 4 苔黑酚 三氯化铁试剂 参见上一个实验 操作步骤操作步骤 1 标准曲线的绘制 取试管 6 支 按下表编号并加入试剂 试剂012345 RNA 标准液 ml00 40 81 21 62 0 蒸馏水 ml2 01 61 20 80 40 苔黑酚试剂 ml2 02 02 02 02 02 0 32 加毕 混匀 置沸水浴中加热 45min 冷却