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分子克隆技术 限制性内切酶 特定的识别序列 4 6个碱基对在识别序列内固定位置切割 5 端磷酸基因 3 端羟基基团切割后形成粘性或平滑末端 CATCGACGAATTC GTAGCTGCTTAAG GAATTCTGCCAGGT EcoRI酶切位点 双链切开 CTTAAGACGGTCCA CATCGACG AATTC G CTTAA GACGGTCCA AATTCTGCCAGGT G DNA连接酶 形成新的DNA双链 GTAGCTGCTTAA AATTCTGCCAGGT CATCGACG GACGGTCCA GTAGCTGCTTAA 限制性内切酶和DNA连接酶 质粒 细胞内独立于染色体外的环状DNA 能自我复制其上基因可借助宿主细胞的转录 翻译系统得以表达分子2000 50000bp pGEM Tvectormap Sub cloningconstructionofrecombinantpCIA PinsertionofA PDNAfragmentintoplasmidpCI 构建质粒的特点 Ori区 复制起点Par区 保证质粒均匀分布于子细胞多克隆区 人为构建 便于克隆操作选择因子 含特定基因 如耐抗生素基因 使克隆后便于挑选 接合 在适当的条件下 雄性菌和雌性菌混合时形成配对的雄性 雌性菌 并有遗传物质的单向转移 雄性菌 含F性因子 染色体外环状DNA 转化 外源DNA能进入细胞内并通过整合至宿主DNA中或独立复制保存于宿主细胞内 转录 利用噬菌体为媒介 将供体DNA转移到受体菌内的现象 能在自然状态下发生 分子克隆常用技术 DNA电泳基因转移核酸杂交聚合酶链反应PCR DNA电泳 可分离不同分子量的DNA 对临床菌株的第二次PCR扩增产物电泳图谱分析Lane1 7 临床菌株S sobrinus Lane8 14 临床菌株S mutans 核酸杂交 原理 在一定条件下 温度 pH值等 DNA双股螺旋可解开并分离在一定条件下 两股游离的互补的核苷酸可自行配对形成双股 SouthernBlot 电泳 转移 杂交确定分子量 斑点杂交 目标序列的存在目标序列的量 聚合酶链反应PCR 细菌形态生化反应免疫反应分子生物学方法 分子探针杂交 RFLP PCR 唾液在与龋病相关微生物检测中的应用 与龋病相关微生物的定量检测方法 在人类口腔中检出率很高茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损活跃性之间的关系更密切 变形链球菌和茸毛链球菌 唾液在与龋病相关微生物检测中的应用 套式PCR快速检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌 谭海平 边专 樊明文 陈智 范兵 中华口腔医学杂志 2003 38 223 226 唾液在与龋病相关微生物检测中的应用 套式PCR NestedPCR 5 3 Template Outerprimer2 Outerprimer1 ThefirstPCR 5 3 Interprimer2 Interprimer1 Nexttemplate ThesecondPCR 5 3 ThesecondPCRproduct 本套式PCR的引物是分别根据变形链球菌gtfB基因和茸毛链球菌gtfI基因设计的内 外两套引物 outerprimer interprimer gtfBgeneofS mutans Outerprimerthp4 Outerprimerthp3 ThefirstPCR Interprimerthp8 Interprimerthp7 Outerprimerthp6 gtfIgeneofS sobrinus Outerprimerthp5 ThefirstPCR Interprimerthp10 Interprimerthp9 ThesecondPCR ThesecondPCR 抽提细菌染色体DNA Igarashietal 1996 细菌 唾液PCR反应过程第一次PCR反应预变性 94 4min变性 94 1min退火 51 1min30cycles延伸 72 2min最后延伸 72 5min第二次PCR反应 abcdefghLadder12345678 选择外引物行第一次PCR后扩增产物电泳图谱分析以变链菌组 MutansStreptococci 染色体DNA为模板Lane1 S cricetusAHT 2 S rattusBHT 3 S mutansIngbritt 4 S sobrinusOMZ176 5 S mutansLM 7 6 S mutansOMZ175 7 S sobrinus6715 8 S downeiMfe28 MW Kb 2 01 00 250 1 0 750 5 abcdefghLadder12345678 选择内引物行第二次PCR后扩增产物电泳图谱分析Lane1 S cricetusAHT 2 S rattusBHT 3 S mutansIngbritt 4 S sobrinusOMZ176 5 S mutansLM 7 6 S mutansOMZ175 7 S sobrinus6715 8 S downeiMfe28 Marker DL2 000Ladder MW Kb 2 00 750 5 1 0 0 25 0 1 Ladder123456 第一次PCR的灵敏度变形链球菌S mutansIngbritt的数量Lane1 108CFU Lane2 107CFU Lane3 106CFU Lane4 105CFU MW Kb 2 00 750 5 1 0 0 25 2 00 5 Ladder123456 1 00 75 0 25 MW Kb 第二次PCR的灵敏度变形链球菌S mutansIngbritt的数量Lane1 104CFU Lane2 103CFU Lane1 chromosomalDNAfromS mutansIngbritt 2 chromosomalDNAfromS sobrinus6715 3 salivasamplefromsubjectA 4 salivasamplefromsubjectB 5 salivasamplefromsubjectC 利用PCR直接从唾液样本中检测变形链球菌S mutans和茸毛链球菌S sobrinus 图A 利用外引物 图B 利用内引物 RealTimePCR 在PCR反应体系中加入能结合到扩增产物上的荧光物质 并通过RealTimePCR检测系统对PCR反应过程中的荧光信号强度进行实时监测 最终对实验数据进行分析处理的方法适应于定量 RealTimePCR应用 基因表达分析 mRNA SNP分型基因拷贝数变化 DNA 转基因食物的定量分析 RealTimePCR原理 一 PCR每进行1个循环 DNA呈2倍的指数关系增长 不久到达平台期 起始的DNA量越多扩增产物便越早达到阈值 也就是扩增曲线越早起峰 将已知浓度的标准品梯度稀释进行RealTimePCR 就会按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列曲线 RealTimePCR原理 二 再由Ct值 达到阈值时的循环次数 与起始模板量的对数值之间存在的线性关系 就可以制作成下图所示的标准曲线 未知浓度的样品与标准品相同 也可以得到Ct值 将Ct值代入标准曲线