祛风湿类方药

祛风湿类方药的 研 究 思 路 与 方 法,10.11,中医药对祛风湿类方药功效认识,具有祛风、散寒、除湿之功；临床用于治疗风、寒、湿引起的痹症。痹证为人体肌表经络遭受风、寒、湿邪侵袭后，气血运行不畅从而引起筋骨肌肉关节的疼痛、肿胀、麻木和活动障碍等表现。,现代医学对祛风湿类方药功效认识,痹证表现类似于现代医学的结缔组织疾病、自身免疫性疾病、骨与骨关节病及软组织疾病等，如风湿热、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、慢性纤维组织炎等。机体免疫功能异常、内分泌功能紊乱以及感染等是该类疾病的主要发病因素。,祛风湿类方药的研究思路,1. 抗炎作用红、热是由于炎症局部血管扩张、血流加快所致。肿是由于局部炎症性充血、血液成分渗出引起。疼痛是由于渗出物压迫和某些炎症介质直接作用于神经末梢而引起。,渗出是炎症最具特征性的变化。白细胞游出是炎症反应最重要的指征，游出的白细胞在炎症灶局部可发挥吞噬和免疫作用，因而成为炎症防御反应中重要的一环。炎症介质：血管活性胺，如组胺和5-羟色胺；花生四烯酸代谢产物，如前列腺素（PG）和白三烯（LT）；氧化产物，如过氧化氢和羟自由基；细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF-）和白介素（IL）等。,组胺、前列腺素等可引起血管通透性增加；白介素、肿瘤坏死因子可引起白细胞趋化游走；前列腺素、白介素等亦可引起发热、疼痛等反应。,2. 镇痛作用,在组织损伤或发炎时，局部产生或释放某些致痛化学物质（也是炎症介质）如组胺、缓激肽、前列腺素等，刺激感觉神经末梢传入冲动，冲动传至高级中枢引起痛觉。阻断使游离神经末梢产生痛觉过程的任一环节，均可产生镇痛效应。,根据镇痛的主要作用部位不同，一般分为外周性与中枢性镇痛。外周性镇痛，常分析药物对致痛因子（如缓激肽、组胺等）或痛觉增敏因子（如PGE2）的作用。中枢性镇痛，常观察药物的作用与中枢有关递质的水平及其受体的关系。,3. 免疫抑制作用,自身免疫性疾病是机体免疫的应答力过盛，而识别力减弱，导致免疫系统不但攻击外源性病原体和变性细胞，而且也侵犯自身的健康组织，把自身组织当外来异物进行攻击，最后使自身机能系统发生障碍，导致机体产生疾病。,与自身免疫有关的疾病：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、风湿热、雷诺氏病、结节性动脉周围炎、硬皮病、皮肌炎、白塞氏综合征等。自身免疫性疾病需用免疫抑制剂治疗。不少祛风湿类方药，如五加皮、独活、雷公藤、清风藤等对机体免疫功能有明显的抑制作用。,风湿性疾病主要表现为T细胞介导的细胞免疫功能紊乱与B细胞介导的体液免疫亢进为主的异常特异性免疫应答。抗原递呈细胞、T细胞、B细胞及其分泌的许多细胞因子参与了机体特异性免疫应答的抗原识别、细胞活化及免疫效应三个过程。,抗原识别：抗原递呈细胞加工处理抗原，将抗原肽提呈给抗原特异性淋巴细胞的过程。机体的抗原递呈细胞主要有巨噬细胞、树突状细胞、郎汉斯细胞。可使T细胞激活，同时T细胞将抗原信息传递给B细胞，激活B细胞。抗原递呈细胞是启动免疫应答的关键因素，体内研究方法可采用巨噬细胞（M）活性检测，体外研究方法采用细胞培养，通过比较抗原递呈细胞死亡、凋亡的数量评价袪风湿方药对致敏阶段是否有干预作用。,细胞活化：T细胞识别抗原后,活化、增殖,分化成记忆T细胞和效应T淋巴细胞;B细胞识别抗原后,活化、增殖,分化成记忆细胞和浆细胞。袪风湿方药可通过影响机体免疫细胞的增殖、分化发挥免疫干预作用。T淋巴细胞计数的一种重要方法，植物血凝素(PHA)、刀豆素(ConA)诱导T淋巴细胞转化增殖试验是观察T淋巴细胞功能的体外试验;迟发型超敏反应（DTH）方法是T细胞免疫功能体内测定。体外抗体形成细胞（PFC）测定方法又称溶血空斑试验,T细胞根据表面抗原分为CD4+ T细胞和CD8+ T细胞两个亚群。CD4+ T细胞分泌辅助T细胞（TH）及迟发性变态反应T细胞（TD）；CD8+ T细胞分泌抑制T细胞（TS）及杀伤性T细胞（Tc）。其中TH分为Th1和Th2两个亚类，Th1细胞主要分泌IFN- ,IL- 2和TNF- ；Th2细胞主要分泌抗炎因子IL-4,IL-10和IL-13,主要参与体液免疫。,风湿性关节炎患者CD4+/CD8+比值较正常人高, Th1细胞明显增多并占势,Th1/Th2细胞的比值与疾病的活动程度明显相关。CD4+ /CD8+ T细胞和Th1/Th2细胞的比值也常被作用为袪风湿方药研究的一个重要指标。,免疫效应：效应T细胞、抗体和细胞因子是共同发挥免疫效应的执行单位。检测免疫分子有助于阐明药物对机体免疫应答的调节机制。免疫分子的检测主要分为免疫学、生物学和分子生物学三种检测方法。免疫学方法主要采用双位点酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法定量检测细胞因子，分子生物学方法主要检测细胞因子mRNA表达水平。,4. 对骨关节的影响,关节和滑膜损害是类风湿性关节炎最主要的病变。由于炎性细胞浸润和炎症介质增加，巨噬细胞样及成纤维细胞样的滑膜细胞增生，使滑膜明显增厚。在滑膜与软骨，或滑膜与骨交界处，血管数量明显增多，形成血管翳，后者进入骨及软骨，破坏骨和软骨组织。类风湿性关节炎晚期，由于纤维组织增生或钙化形成而导致关节强直和关节畸形。减轻滑膜的炎性浸润，抑制炎症介质的产生，减轻滑膜细胞和纤维组织增生，可缓解骨关节损害。,祛风湿类方药的常用研究方法,1抗炎实验（1）毛细血管通透性实验法 常用染料渗出法。静脉内注入染料伊文思蓝，当致炎因子导致毛细血管通透性升高时，伊文思蓝可经毛细血管壁渗入周围组织。提取组织中伊文思蓝，用比色法或荧光法定量测定，可反映毛细血管通透性变化的程度。,【操作方法】 用200250g大鼠，随机分组，分别给予受试药物、阳性对照药及生理盐水。 30min后，在大鼠背部已剃毛的部位，皮内注射 l00g/ml的组胺(0.050.1m)或 lg/ ml 5-羟色胺(0.050.1ml)，立即静脉注射（舌下静脉或股静脉）1%伊文思蓝（Evans）45ml/kg。 15min后断头放血处死动物，将大鼠背部着色的皮肤剪下，切碎，放入水-丙酮溶液（37）内浸泡2448h，过滤，分光光度计比色测定，比较给药组与对照组着色程度的差异。,（2）白细胞游走实验,【原理】 用羧甲基纤维素（CMC）致炎后，测定炎症渗出液中白细胞的数量，判断受试药的抗炎效果。【操作方法】 选用15020g雄性大鼠，随机分组，背部剃毛或脱毛，乙醚麻醉，无菌操作下在背部肩胛间区（背正中）皮下注射5ml空气，形成圆形气囊，次日用药，给药后0.5lh，向囊内注入 1.5羧甲基纤维素（CMC）溶液5ml。分别于3, 7 h从囊内吸取CMC液0.1ml,移至3ml亮甲酚蓝染液中，混匀后于显微镜下计数白细胞数，再计算每囊内白细胞总数。,四种穿心莲内酯（甲、乙、丙、丁素）对大鼠CMC囊中白细胞游走的影响,与对照组相比较，*P0.01。,（3）急性关节肿实验法,将致炎剂注入大鼠足跖，常用致炎剂有蛋清（10）、角叉菜胶（1）、甲醛（2.5）等。用容积测量仪测定足容积，或用软皮尺测量踝关节周长，也可用千分尺测量足跖厚度。比较各鼠致炎前后的测量值，并以两者间的差值为肿胀度。不同致炎剂诱导炎性水肿的机制有别，其达峰与持续时间不同，因此致炎后测定的时间间隔与次数因致炎剂不同而异。,致炎剂的种类和浓度（注入量一律为0.050.1ml）,（4）小鼠耳肿胀法,操作方法将致炎液涂在小鼠左耳前后两面，约涂0.lml（致炎液中含2巴豆油、20无水乙醇或单用二甲苯等），右耳作对照。 致炎前0.51h肌内、腹腔注射或灌胃给予受试药物。约2h后将小鼠断颈处死，沿耳廓基线剪下两耳，用9mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片，用组织天平称重。每鼠的左耳片重量减去右耳片重量即为肿胀程度。,（5）棉球肉芽肿法,将干燥灭菌的棉球（1050mg）埋入大鼠腹股沟皮下，主要诱导产生与临床某些炎症后期病理变化相似的肉芽增生，观察药物有无对抗结缔组织增生的作用。例：各鼠皮下均埋棉球，次日开始，每日分别腹腔注射细辛油0.24mlkg、生理盐水及醋酸可的松40mgkg，共7日。末次给药后1h，将大鼠处死，剥取棉球肉芽组织，在90烘箱内干燥lh后称重。,细辛挥发油对棉球肉芽肿的影响,与对照组比较，*P0.05,（ 6）免疫性关节炎法（亦称佐剂多发性关节炎法）,将福氏完全佐剂（Freunds complete adjuvant，FCA）0.05ml皮内注入大鼠足跖或尾根部致炎。Freunds完全佐剂:系用液体石蜡和羊毛脂（21）共热至70，振摇，高压灭菌。然后按每毫升加人卡介苗或死结核杆菌（乳酪分支杆菌亦可） 6mg左右ml）制成。,模型鼠可历经急性局部炎症（第14天）；多发性关节炎为特征的慢性周身炎症（第1028天一般表现为对侧后肢和前肢脚爪肿胀 ；永久性关节畸形（第35天以后，一般表现为耳和尾部出现“关节炎”小结及体重明显下降）。,此模型与单核细胞的异常活化和抑制性T（Ts）细胞功能的降低有关。大鼠不同品系的易感性有差异；一般常选用SD与Wistar等品系的大鼠。这是一种迟发性过敏反应，此模型类似于人的类风湿关节炎，用以筛选对风湿、类风湿性关节炎有效的药物。,2镇痛实验,（1）热板法-热刺激致痛法 选用雌性小鼠，测定每鼠的痛阈（即痛反应潜伏期，指小鼠接触热板至舔后足的时间）。筛选痛反应潜伏期在530秒内为合格鼠，然后分组给药，定时检测。若受试药物使痛反应潜伏期延长，说明可能有镇痛作用。本法简便易行。,（2）扭体法-化学物质刺激致痛法 常用小鼠，腹腔注射醋酸（0.6；0.2ml/只）或酒石酸锑钾（0.06，0.2 ml/只）致痛。观察指标为10、20 min内扭体次数，或出现扭体反应的动物数，分别以扭体减少数和抑制率计算药效。本法是筛选非甾体抗炎药镇痛作用的一种敏感而简便的方法，但缺乏特异性，许多非镇痛药亦可出现阳性结果。因个体差异性较大，故腹腔注射致痛剂的部位和操作技术应尽量力求一致。,（3）鼠尾电刺激法 在小鼠或大鼠尾部的两个部位插入电极，逐渐加大进行电刺激强度，以动物产生嘶叫为指标,比较用药前后痛阈值的变化，以测定药物的镇痛效应。,光照甩尾法也叫光热甩尾法或辐射热甩尾法，其基本原理是将一束光照射到鼠尾上产生集热效应，使鼠尾的局部升温产生疼痛，当超过动物忍耐的痛阈时动物就产生有效的甩尾逃避，以此方法来判断动物痛阈的高低和变化.,3.对免疫功能影响实验（1）腹腔巨噬细胞吞噬细胞功能取小鼠按下表分组给药，每日1次，连续5日,腹腔注射1%鸡红细胞悬液0.5ml，1h后用颈椎脱臼法处死小鼠，立即腹腔注射生理盐水2ml生理盐水，并按摩小鼠腹部，吸取0.5ml腹腔液滴片，吉氏法染色，油镜观察：吞噬百分率100个腹腔巨噬细胞中吞噬了鸡红细胞的个数；吞噬指数平均每个腹腔巨噬细胞吞噬了鸡红细胞的个数。,虫草多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬细胞功能的影响（Xs）,（2）单核吞噬细胞功能测定法- 小鼠碳粒廓清法【原理】常用一些颗粒状异物（如胶体碳、印度墨汁等）静脉注入小鼠或家兔血循环后，迅速被单核吞噬细胞所清除，主要被定居在肝和脾脏的巨噬细胞所吞噬。若异物量恒定，其从血流中消除的速率可反映单核吞噬细胞的吞噬功能。 在一定范围内，颗粒的清除速率与血中颗粒浓度成正比，而与已吞噬的颗粒量成反比。如以不同时间测得的血中颗粒浓度之对数值为纵坐标，时间为横坐标作图，则两者呈直线关系。此直线斜率（K）可表示吞噬速率。,【操作方法】 取1822g健康小鼠，随机分成待试药组，对照组，一般中药制剂均于实验前给药一定时间（37日），于末次给药30min后，尾静脉注射印度墨汁 0.050.lml10g（体重），注射后不同时间（如 2min、20min）用吸管（预先用肝素溶液湿润）分别从眶后静脉丛取血20l，溶于2ml 0.1Na2CO3溶液中摇匀，置721型分光光度计在波长600680nm下比色，测定光密度（OD）。按下式计算廓清指数K。,注：OD1 、OD2 为不同时间所取血样的光密度，t2t1为取两血样的时间差，各组的K值，进行组间t 测验，比较差异的显著性。,（3）迟发型超敏反应（DTH）,原理： 当一定的抗原（致敏原）如二硝基氯苯（DNCB），二硝基氟苯（DNFB）与动物皮肤接触后，可刺激T淋巴细胞转化、增殖为致敏淋巴细胞，经一定时间后（一般47日），再将该抗原涂于动物耳部或足部皮肤（称抗原攻击），则局部便产生DTH反应，一般于抗原攻击后2448h DTH反应达高峰，故于此时测定其耳或足部皮肤的肿胀度。,黑蚂蚁胶囊对二硝基氯苯诱导小鼠DTH反应的影响,（4）淋巴细胞增殖试验有丝分裂原刺激的淋巴细胞增殖反应,MTT法的原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物(MTT)由黄色还原为蓝色的甲臜（formazan） ，后者溶于有机溶剂(如二甲亚砜、无水乙醇或酸化异丙醇等)，甲臜产量与活细胞数成正比。其可在560nm处用酶标仪进行检测。常用的有丝分裂原有伴刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、植物血细胞凝集素（PHA）及美洲商陆（PWN）等 。,钩吻素子对小鼠脾细胞增殖反应的影响,按常规制备C57BL/6j小鼠脾细胞悬液，终浓度为2.5106（个细胞）/ml； ConA终浓度为2g/ml，LPS终浓度为细胞连续培养3日,（5）溶血素测定法 【原理】致敏动物血清中的抗体-溶血素（IgM），与绵羊红细胞一起体外温育，在补体参与下，可产生溶血反应，释放的血红蛋白可用分光光度计比色测定。【操作方法】 (1)取1822g小鼠，随机分组，每鼠腹腔注射按35（V/V）稀释的绵羊红细胞（SRBC）悬液 0.2ml（约4亿个SRBC）进行免疫，药物可在免疫前、后或免疫前后均给予。,