基因工程操作的工具酶.ppt

第二章基因工程操作的工具酶 2 1基因工程工具酶 1 工具酶的概念2 限制性内切酶3 DNA聚合酶4DNA连接酶5 碱性磷酸酶6末端转移酶7核酸酶S18T4多核苷酸激酶 1 工具酶的概念应用与基因工程的各种酶的总称 切 连 修饰 2 限制性内切酶 主要从细菌中分离得到 核酸水解酶 酶识别特定的核苷酸顺序 但在细菌本身的DNA中 这些顺序已被甲基化修饰 因而不被水解 这些酶仅限于水解外源DNA以保护自身 故称之为 限制性 酶 以内切方式水解DNA 产物的5 为p 3 为OH 限制性内切酶的发现 Luria和Human发现 K噬菌体 Ecoli B噬菌体 Ecoli广泛存在于原核细菌 由宿主控制的对外源DNA的限制 restriction 和对内源DNA的修饰 modification 现象称为宿主细胞的限制和修饰作用 作用 一 保护自身DNA不受限制 二 破坏入侵的外源DNA 使之降解 Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种酶 能够特异性的切割DNA 这个酶被命名为HindI 这是第一个分离到的限制性内切核酸酶 限制性内切酶的定义 指限制修饰系统中的一个组成部分 具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列 并由此切割DNA双链结构的酶统称为限制性内切酶 限制性内切酶分类 根据限制性内切酶的识别顺序与切割位置是否一致 将它们分成三类 型型限制性内切酶 型限制性内切酶 型限制性内切酶 I型限制性核酸内切酶具有核酸内切酶 甲基化酶 ATP酶和DNA解旋酶四种活性 其切割作用是随机进行的 一般在距离识别位点上千碱基对以外的随机位置上切割 不产生特异片段 型限制性核酸内切酶是由两个亚基组成的蛋白质复合物 具有限制与修饰双重作用 切割位点则在识别序列一侧的若干碱基对处 无序列特异性 只与识别位点的距离有关 而且不同酶的这一距离不同 型限制性内切酶 3个基本的特征 在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子 识别序列的碱基数一般为4 6 8个bp 识别位点经常是一种回文序列的DNA 限制性酶的识别序列一般为4 8个核苷酸 这些序列大多呈回纹结构 EcoR 识别6个核苷酸序列 在特定的G A之间切割DNA分子 5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5 Pst 酶切5 C T G C A G 3 3 G A C G T C 5 Sma 酶切5 C C C G G G 3 3 G G G C C C 5 Bal 酶切识别6个核苷酸的序列 在特定的G C之间切割DNA分子 5 T G G C C A 3 3 G A C G G T 5 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相对的 Pst 酶切5 C T G C A G 3 3 G A C G T C 5 断裂结果形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端 EcoR 5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5 限制性核酸内切酶的命名 按酶来源菌的属 种名而定 取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示 如有株名 再加上一个字母 其后再按发现的先后写上罗马数字 例如 从流感嗜血杆菌d株 Haemophilusinfluenzaed 中先后分离到3种限制酶 则分别命名为Hind Hind 和Hind 常见的限制性内切酶限制性核酸内切酶名称识别序列和切割点EcoR G AATTCHind GTPy PuACHind A AGCTTBsuRIGG CC Pst CTGCA GSma CCC GGGXba T CTAGAXho C TCGAGBamH G GATCCNot GC GGCCGC 5 GAATTC 3 EcoRIGAATTC5 粘端3 CTTAAG 5 CTTAAG5 CTCGAG 3 PstICTCGAG3 GAGCTC 5 GAGCTC3 粘端5 CCCGGG 3 SmaICCCGGG平末端3 GGGCCC 5 GGGCCC 限制酶产生末端的连接 a 粘性末端互补 CTCGAAGCTTGTTC GGCAAGCTTACT GAGCTTCGAACAAG CCGTTCGAATGAHindIII酶解HindIII酶解 CTCGA AGCTTGTTC GGCA AGCTTACT GAGCTTCGA ACAAG CCGTTCGA ATGA 混合退火 GGCAAGCTTGTTC CCGTTCGAACAAG 切口 b 不匹配末端连接 AAGCTT TCTAGA TTCGAA AGATCTHindIIIXbaI ACTAGA TTCGATKlenow酶填补 AAGCTAGA TTCGATCT AAGCTAGA TTCGATCT C 平末端连接 AAGCCCGGGTCG GGAGGTTAACCT TTCGGGCCCAGC CCTCCAATTGGASmaI酶切AAGCCC OHP GGGTCG GGAGGTT OHP AACCTTTCGGG POH CCCAGC CCTCCAA POH TTGGA 混合退火OHP GGAGGTTGGGTCG CCTCCAACCCAGC 内切酶的切割方式 1 同位酶 具有相同的识别序列 但是酶切位点不同 SmaI CCC GGG 和XmaI C CCGGG 识别序列相同 但切割位点不同 前者产生平头末端 后者产生黏性末端它们是一对同位酶 2 同尾酶 具有不同的识别序列 但是酶切产物有相同的末端结构 如BamHI 5 G GATCC 3 与Bgl 5 A GATCT 3 的酶切片段可以彼此连接起来 3 同裂酶 来自不同物种 但是识别序列和酶切位点均相同 例如 Hpa 5 GTT AAC 3 Hinc 酶切GTY RAC 核酸内切酶的缓冲液性质 高浓度的酶 高浓度的甘油 低离子强度 极端pH值等 会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性 即所谓的星活性 Staractivity 现象 EcoRI在正常条件下识别并切割5 GAATTC3 序列 但在甘油浓度超过5 v v 时 也可切割5 PuPuATPyPy3 或者5 AATT3 大肠杆菌中的甲基化酶dam甲基化酶 可在5 GATC3 序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基 dcm甲基化酶此酶在序列5 CCAGG3 或5 CCTGG3 中的胞嘧啶C5上引入甲基 受其影响的限制性内切酶是EcoRII 3 腺嘌呤脱氧核苷酸 3 dAMP H O H O P O CH2 O O H H H NH2 N H N N CH N 9 HO N O N H C CH3 NH2 5 胞嘧啶核苷酸 5 CMP H O H O P O CH2 O O H H OH OH 甲基化酶在基因工程中用途 许多II类限制性内切酶 都存在着相对的甲基化酶 它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上 封闭酶切位点 从而使其免受切割 型限制性核酸内切酶的反应条件 在合适的温度和缓冲液中 在20 l反应体系中 1h完全降解1 gDNA所需要的酶量 称为一个单位的限制性核酸内切酶 酶过量可导致识别序列的特异性下降 应注意的问题 1浓缩的酶液要稀释 不能用水 2低温保存一20 稳定保存 影响限制性核酸内切酶活性的因素 1 DNA的纯度 DNA制剂中的其他杂质 如蛋白质 酚 氯仿 酒精 乙二胺四乙酸 十二烷基硫酸钠 SDS 以及高浓度的盐离子等 都有可能抑制限制性核酸内切酶的活性 2 DNA的甲基化程度 内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列 通常使用丧失了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA 若要使用合成的衔接物修饰DNA片段的末端 被酶切之前 通过甲基化将内部的限制酶识别位点保护起来 3 酶切反应的温度 大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度是37 但Sma 是25 ApaI是30 4 DNA的分子结构 超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高达20倍 5 限制性核酸内切酶的缓冲液 标准缓冲液的组分包括 氯化镁 氯化钠或氯化钾 Tris HCl 一巯基乙醇或二硫苏糖醇 DTT 以及牛血清白蛋白 BSA 等 酶活性需要2价阳离子 通常是Mg2 3 DNA聚合酶 分为两类 依赖于DNA的DNA聚合酶 包括大肠杆菌DNA聚合酶I 全酶 大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶 T4DNA聚合酶 T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等 依赖于RNA的DNA聚合酶 有逆转录酶 DNA聚合酶 1 大肠杆菌DNA聚合酶I E coliDNApolI 也称为Kronberg酶 是Kronberg等1956年发现的第一个DNA聚合酶 具有三种酶活性a 5 3 DNA聚合酶活性CCGATA OHE coliDNApolICCGATAGCCTGGCTATCGGAMg2 dNTPGGCTATCGGA b 3 5 外切酶活性CGCATCG OHE coliDNApolICGCATCGGCGMg2 dNTPGCG校正作用 c 5 3 外切酶活性CGCATTAGE coliDNApolICATTAGGCGTAATCMg2 GCGTAATC 2 Klenow酶 也称DNA聚合酶I大片段 Klenow片段或K1enow聚合酶 只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5 3 外切酶活性 具有5 3 聚合酶活性 3 5 外切酶活性 Klenow酶的基本用途 a 补平由核酸内切酶产生的5 粘性末端b DNA片段的同位素末端标记c cDNA第二链的合成d 双脱氧末端终止法测定DNA序列 3 TaqDNA聚合酶 是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶 具有5 3 聚合酶活性和3 5 外切酶活性 需要Mg2 作辅助因子 该酶最适反应温度为75 80 主要用途是进行PCR反应 4 逆转录酶 依赖于RNA的DNA聚合酶 AMV逆转录酶 鸟类成髓细胞性白血病病毒 M MLV逆转录酶 Moloney鼠白血病病毒 AMV逆转录酶反应的最适温度为41 45 最适pH为8 3 主要作用是将mRNA反转录成cDNAa DNA聚合酶活性b RNaseH活性 特异地降解DNA RNA杂交分子中的RNA链 c DNA内切酶活性d DNA指导的DNA聚合活性 T4噬菌体DNA聚合酶 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌 具有 5 3 聚合酶活性3 5 外切酶活性 外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA更强 外切酶活性比Klenow酶高100 1000倍 可以补平或标记带3 凹陷末端的DNA分子 可进行平头末端或3 突出末端的双链DNA的标记 T7噬菌体DNA聚合酶 持续合成能力最强的酶 具有很强的对单链和双链DNA的3 5 外切酶活性 主要用于催化大分子模板 如M13噬菌体 的引物延伸反应 它可以在同一引物模板上有效地合成数千个核苷酸且不受二级结构的影响 测序酶 测序酶是通过化学修饰对T7噬菌体DNA聚合酶进行改造的酶 去除T7噬菌体DNA聚合酶的3 5 外切酶活性 保留聚合活性 具有很强的持续合成能力 是Sanger双脱氧链终止法测序的理想用酶 4 DNA连接酶 1967年发现 两条DNA链之间形成磷酸二酯键 DNAligase Ecoli和其他细菌 能源 NAD 动物细胞及噬菌体 能源 ATP 连接酶的作用是 将互补配对的两个黏性末端连接起来 使之成为一个完整的DNA分子 1 T4噬菌体DNA连接酶不受dNTP的抑制 催化DNA片断的连接 2 E coliDNA连接酶不能连接平端DNA 不能连接RNA DNA连接酶的反应条件Tris HCl50 100mM pH7 5MgCl210mM ATP0 5 1mM DTT5mMVolume 10 20 lTT 4 15 4 16hr1UDNA连接酶的酶活性 在最佳反应条件下 15 反应1小时 完全连接1 g DNA HindIII片段 所需的酶量 平头双链DNA片段的连接操作粘性末端的连接属于分子内部的连接 平头末端的连接属于分子间的连接 反应速度慢 提高平头末端连接效率的方法包括 a 加大连接酶用量 b 加大平头末端底物的浓度 增加分子间碰撞机会c 加入10 PEG8000 促进大分子之间的有效作用d 加入单价阳离子 NaCl 最终浓度150 200mM 5 碱性磷酸酶 去除DNA或者RNA的5 磷酸 可防止自身环化 5 pDNA5 OHDNA5 pRNA5 OHRNA 分类 1 BAP bacterialalkalinephosphatase 细菌碱性磷酸酶 来源于大肠杆菌 活性高 但耐高温和去污剂 抑制其活性较难 2 CIP calfintestinalalkalinephosphatase 牛小肠碱性磷酸酶 来源于小牛肠 蛋白酶K消化 EDTA参与下 65 加热1小时灭活 碱性磷酸酶的主要用途有 1 5 末端标记前的处理 2 去除DNA片段的5 磷酸基团 防止自身连接 6 末端转移酶 分子量60000D 在二价阳离子的作用下 催化dNTP加于DNA分子的3 羟基端 底物 带3 羟基端单链DNA或带3 羟基突出端的双链DNA 用途 1 载体或者cDNA加同聚尾 2 标记DNA3 末端 7 核酸酶S1 S1核酸酶的基本特性 来自稻谷曲霉菌 Aspergillusoryzae 水解单链核酸以及双链核酸中的单链区或单链末端 产生5 核苷酸和5 末端为p的寡核苷酸 Zn2 必需 最适pH范围为4 0 4 3 需要NaCl10 300mM 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍 S1核酸酶降解单链DNA或RNA 产生带5 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸 需要辅助因子Zn 用途 1 去除DNA片断中突出的单链尾以产生平端 2 打开双链cDNA合成中产生的发夹 带切口的双链DNAS1核酸酶 8 T4噬菌体多核苷酸激酶催化ATP的 磷酸基团转移到DNA或RNA的5 末端 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞 已在多种哺乳动物细胞中发现了多核苷酸激酶 用途 1 标记DNA或RNA5 末端 2 对缺乏5 磷酸基团的DNA进行磷酸化或者合成接头进行磷酸化 9 DNase 从牛胰中分离到的内切酶 水解双链DNA比单链DNA迅速 随着反应进行 双链底物减少 单链浓度增加 反应自动减速 酶反应的最适pH在7左右 Mg2 Mn2 和Co2 是激活剂 10 核糖核酸酶A 特异攻击RNA上嘧啶残基的3 端 切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键 举例