高中生物《血红蛋白的提取和分离》教案4 新人教版选修1

用心 爱心 专心1 课题 血红蛋白的提取和分离课题 血红蛋白的提取和分离 教学目标 教学目标 1 尝试从血液中提取和分离血红蛋白 2 了解色谱法 电泳法等分离生物大分子的基本原理 教学重点 教学重点 凝胶色谱法的原理和方法 教学难点 教学难点 样品的预处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 教学过程 教学过程 一 引入新课 一 引入新课 蛋白质是生命活动的主要承担者 是细胞内含量最高的有机化合物 对蛋白质的研究 有助于人们对生命过程的认识和理解 所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究 怎样提取 蛋白质呢 二 进行新课 二 进行新课 1 1 基础知识 基础知识 蛋白质的物化理性质 形状 大小 电荷性质和多少 溶解度 吸附性质 亲和力等 千差万别 由此提取和分离各种蛋白质 1 1 凝胶色谱法 分配色谱法 1 原理 见课件图 分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙 路程短 流动 快 分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部 路程长 流动慢 2 凝胶材料 多孔性 多糖类化合物 如葡聚糖 琼脂糖 3 分离过程 混合物上柱 洗脱 大分子流动快 小分子流动慢 收集大分子 收集小分子 洗脱 从色谱柱上端不断注入缓冲液 促使蛋白质分子的差速流动 1 2 缓冲溶液 1 原理 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成 如 H2CO3 NaHCO3 HC NaC NaH2PO4 Na2HPO4等 调节酸和盐的用量 可配制不同 pH 的缓 冲液 2 缓冲液作用 抵制外界酸 碱对溶液 pH 的干扰而保持 pH 稳定 1 3 凝胶电泳法 1 原理 不同蛋白质的带电性质 电量 形状和大小不同 在电场中受到的作用力 大小 方向 阻力不同 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同 思考 阅读投影补充材料后 填写下表 决定运动方 向 形成库仑 力 形成阻 力 决定运动速 率 电荷性 质 电荷量 分子形 状 分子大 用心 爱心 专心2 小 2 分离方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺经胶电泳等 3 分离过程 在一定 pH 下 使蛋白质基团带上正电或负电 加入带负电荷多的 SDS 形成 蛋白质 SDS 复合物 使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小 2 2 实验设计 实验设计 2 1 蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤 样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 思考 是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的 为什么 不是 因为蛋白质的来源和性质不同 分离方法差别很大 2 2 选择实验材料 1 你认为鸟类血液和哺乳动物血液中 最好哪种血液来提取血红蛋白 为什么 哺乳动物血液 因为该细胞中没有细胞核 血红蛋白含量高 2 请阅读投影资料 认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质 并思考回答下列问题 血液由 和 两部分组成 血细胞中 细胞数量最多 细胞的含量最高的化合物是 该化合物是由 和 构成的 其中每个亚基中都含有一个能与 O2和 CO2结合 的 基团 2 3 从红细胞中分离出血红蛋白的过程为 洗涤红细胞 释放血红蛋白 分离血红蛋白 透析 洗涤红细胞的目的是什么 除去血浆蛋白的杂蛋白 有利于后续步骤的分离纯化 红细胞的洗涤过程为 血液 柠檬酸钠 低速短时离心 吸出上层血浆 红细胞 5 倍体积生理盐水 缓慢 搅拌 10min 低速短时离心 吸出上清液 反复洗涤直至上清液无黄色 思考 加入柠檬酸钠有何目的 为什么要低速 短时离心 为什么要缓慢搅拌 防止血液凝固 防止白细胞沉淀 防止红细胞破裂释放出血红蛋白 思考 你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来 加入蒸馏水 用玻璃棒快速搅拌一段时间 补充 加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同 加入甲苯的目的是溶解细胞 膜 有利于血红蛋白的释放和分离 此时 红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白 而且 还含有细胞破碎物 脂质 甲苯有机溶剂等 怎样除去这些杂质呢 由于它们的密度不同 科学家采取了离心分离的方法 红细胞破碎混合液 中速长时离心 2000c min 10min 滤纸过滤除去脂质 分液 漏斗分离出血红蛋白 2 4 如何除无机盐离子和小分子有机物质呢 透析 半透膜的选择透过性 大分子物质不能通过半透膜 离子和小分子能够通过半 透膜 在透析过程中 血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到 pH 7 的 磷酸缓冲液中 思考 为何使用 pH 7 的磷酸缓冲液 为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量 维持血红蛋白的正常特性 有利于杂质分子充分地向外扩散 总结 通过以上四个基本过程 红细胞中的血红蛋白就被提取出来 但其中还含有其 他种类的蛋白质分子 如呼吸酶等 怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢 我们来研究蛋 白质提取和分离的第二个步骤 粗分离 凝胶色谱操作 用心 爱心 专心3 2 5 凝胶色谱分离蛋白质包括 制作色谱柱 装填色谱柱 样品加入和洗脱 根据教材图 5 19 说出制作色谱柱需要的材料 橡皮塞 2 个 打孔器 小刀 移液管 尼龙纱 尼龙网 玻璃管 尼龙管等 色谱柱的制作过程 准备材料 加工橡皮塞 安装色谱柱 下面进行第二步 凝胶色谱柱的装填 请阅读教材 色谱柱的装填过程 步骤操作要求 操作要求色谱柱垂直固定在支架上 计算称量凝胶根据色谱柱体积计算凝胶用量 凝胶颗粒 蒸馏水 充分溶胀 配制悬浮液 凝胶颗粒 洗脱液 沸水浴 装填悬浮液一次性缓慢倒入 轻轻敲打 缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡 12h 样品加入和洗脱 其基本过程是 调节缓冲液面 加入蛋白质样品 调节缓冲液面 洗脱 收集分装蛋白质 至此 血红蛋白即可得到粗分离 在整个操作过程中 应当注意以下事项 1 红细胞的洗涤 洗涤次数不能过少 低速 短时离心 2 凝胶的预处理 沸水浴法时间短 还能除去微生物和气泡 3 色谱柱的装填 装填尽量紧密 降低颗粒间隙 无气泡 洗脱液不能断流 4 色谱柱成功标志 红色区带均匀一致地移动 三 课堂总结 点评 三 课堂总结 点评 四 实例探究 四 实例探究 例 1 利用凝胶色谱法 什么样的蛋白质先洗脱出来 A 相对分子质量大的 B 溶解度高的 C 相对分子量小的 D 所代电荷多的 解析 凝集色谱法使根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法 相对分子质量 较小的蛋白质能进入凝胶内部通道 路程较长 移动速度较慢 相对分子质量大的蛋白 质 路程较短 移动速度较快 首先洗脱出来 答案 A 例 2 蛋白质提取和分离分为哪几步 血 红 蛋 白 的 取 和 分 离 凝胶色谱法 原理分离过程 凝胶电泳法 缓冲溶液 组成作用 蛋白质的 提取分离 样品处理粗分离 纯化纯度鉴定 血 红 蛋 白 的 提 取 和 离 蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性 凝胶色谱法 原理分离过程 凝胶电泳法 凝胶色谱法 原理分离过程 凝胶电泳法 缓冲溶液 组成作用 缓冲溶液 组成作用 蛋白质的 提取分离 样品处理粗分离 纯化纯度鉴定 蛋白质的 提取分离 样品处理粗分离 纯化纯度鉴定 用心 爱心 专心4 A 样品处理 凝胶色谱操作 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 B 样品处理 凝胶色谱操作 纯化 C 样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 D 样品处理 纯化 粗分离 纯度鉴定 解析 蛋白质的提取和分离分为样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定四步 A 中凝胶色 谱操作及 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术 答案 C 综合应用综合应用 例 3 用凝胶色谱法分离蛋白质时 分子量大的蛋白质 A 路程较长 移动速度较慢 B 路程较长 移动速度较快 C 路程较短 移动速度较慢 D 路程较短 移动速度较快 解析 在小球体内部有许多贯穿的通道 当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时 相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程较长 移动速度较慢 而 相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在凝胶外部移动 路程较 短 移动速度较快 答案 D 五 巩固练习 五 巩固练习 1 凝胶色谱法分离蛋白质的依据是 A 对其他分子的亲和力 B 溶解度 C 所带电荷多少 D 相对分子质量的大小 2 凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是 A 糖类化合物 B 脂质 C 蛋白质 D 核酸 3 选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料 有何好处 A 血红蛋白是有色蛋白 B 红细胞无细胞核 C 红细胞蛋白质含量高 D 红细胞 DNA 含量高 4 将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时 第二层是 A 甲苯 B 血红蛋白水溶液 C 脂溶性物质的沉淀层 D 其他杂质的沉淀 5 血红蛋白因含有 而呈红色 A O2 B CO C CO2 D 血红素 6 下列操作正确的是 A 分离红细胞时采用低速长时间离心 B 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可 C 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D 透析时要用 20mmol l 的磷酸缓冲液 透析 12h 7 样品的加入和洗脱的叙述正确的是 A 先加入 1ml 透析后的样品 B 加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出 C 如果红色带均匀一致的移动 说明色谱柱制作成功 D 洗脱时可以用缓冲液也可以用清水 8 下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是 A 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液 B 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质 此为样品的粗提取 C 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去 即样品的纯化 用心 爱心 专心5 D 可通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度 9 凝胶色谱法操作正确的是 A 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴 B 将橡皮塞下部切出凹穴 C 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片 10 样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A 加样前 打开色谱柱下端的流出口 使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶 面的下面 B 加样后 打开下端出口 使样品渗入