高级植物病毒学

高级植物病毒学高级植物病毒学 第一讲第一讲 1 病毒 病毒 病毒是一组 一种或一种以上 RNA 或 DNA 核酸模板分子 包被在 蛋白或脂蛋白外壳内 在合适的寄主细胞内 依赖于寄主蛋白合成体系 细胞 物质和能量完成其复制 随着核酸的变化而发生变异 2 病毒与其他类似生物的区别 病毒与其他类似生物的区别 与细胞型寄生物的区别与细胞型寄生物的区别 在细胞内复制期间没有一个连续的膜将病毒与其 寄生分开 在寄主细胞内复制的细胞性寄生物总是以一个连续的双层膜 continuous bilayer membrane 与寄主细胞的细胞质分开 病毒中缺少蛋白质合成的系统 病毒的复制是通过先合成许多组分 随后从组分库中装配出许多病毒粒体 virion 或 virus particle 即使最简单的细胞亦通过二分裂方式进行复制 与质粒的区别与质粒的区别 正常的病毒具有粒子形态 其结构是为在细胞外的环境中 保护遗传物质而设计的 并且能够促进病毒进入新的寄主细胞 病毒基因组为特定的病毒功能而高度地组织化 对寄主细胞没有已知的价值 然而质粒的遗传物质通常对其寄主细胞的生存是有用的 病毒能引起寄主生物的病害或细胞的死亡 但是质粒不会 与衣原体 立克次氏体 支原体的区别 与衣原体 立克次氏体 支原体的区别 大小 一些痘病毒 pox virus 比衣原体的原体更大 基因组的性质和大小 许多病毒有像细胞一样的双链 DNA 并且一些病毒的 DNA 比衣原体中的 DNA 大 DNA 和 RNA 的存在 病毒和支原体都没有坚硬的细胞包膜 在活的寄主细胞外面 病毒与许多类群的专性细胞性寄生物 cellular parasite 如衣原体都不能生长 病毒和衣原体中没有产生能量的系统 病毒和某些细菌所需的氨基酸等完全依赖于寄主细胞 3 专著和刊物专著和刊物 植物病毒学 植物病毒研究方法 植物病毒种类的分子鉴定 Plant Virology 微生物学报 植物保护学报 植物病理学报 Plant Disease Phytopathology Molecular Plant Microbe Interactions Molecular Plant Pathology Virus Genes Archives of Virology Virus Research Journal of General Virology 第二讲第二讲 1 类病毒 类病毒 不具病毒粒体 而是裸露的 RNA 能侵染细胞 进行自我复制 称 为类病毒 2 卫星核酸 卫星核酸 是指依赖于辅助病毒才能复制的线状和环状小分子核酸 其核酸 序列与其辅助病毒无显著的同源性 包装在辅助病毒衣壳蛋白内 3 卫星病毒 卫星病毒 具有独立的核酸和外壳蛋白 必须依赖于辅助病毒才复制的病毒 并与辅助病毒无同源性 一般干扰辅助病毒的复制 4 拟病毒 拟病毒 包被于辅助病毒衣壳内 类似于类病毒的卫星 RNA 大小为 300 400bp 具有高度二级结构的单链闭合环状 RNA 分子 5 蛋白侵染因子 蛋白侵染因子 不含核酸 只含约 30kDa 蛋白质侵染因子 病因未完全明确 暂不列入亚病毒 第三讲第三讲 病毒的核酸类型病毒的核酸类型 1 正单链 RNA ssRNA 单链 RNA 具有侵染性 可以直接翻译 起 mRNA 的作用 大部分重要植物病毒的基因组属这一类型 如 TMV CMV PVY 多分体病毒 2 负单链 RNA ssRNA 病毒粒体中的单链 RNA 不具侵染性 必需先 转录成互补链 才能翻译蛋白 植物弹状病毒的基因组属这一类型 如 NCMV 3 双链 RNA dsRNA 其中一条链具有 mRNA 的作用 负链变正链才能 作为 mRNA 植物呼肠孤病毒的基因组属这一类型 如 RDV 4 单链 DNA ssDNA 联体病毒科病毒含有这种类型基因组 复制时单 链 DNA 先合成双链 DNA 再以常规途径转录生成 mRNA 如 WDV 5 双链 DNA dsDNA 核酸类型与高等动 植物的相同 为互补的双链 DNA 如 CaMV 杆状 DNA 病毒属具有这种类型基因组 第四讲第四讲 1 病毒基因组结构 病毒基因组结构 一般来讲 病毒基因组包括编码区 coding regions 和非 编码区 non coding regions 编码区所表达的蛋白要参与病毒的侵染循环 病毒 在植株内的运动及植株间的传播以及与寄主植物的互作 非编码区调控基因组 的复制与基因表达 但调控序列也可能存在于编码序列内 2 病毒基因组的特点 病毒基因组的特点 基因组大小相差很大 WDV 2 75 kb 痘病毒 300 kb 核酸结构多样性 DNA 或 RNA 单链或双链 环状分子或线性分子 基因组有连续的 有不连续的 大多数连续 RDV 12 条 dSRNA 编码序列 90 基因组 多为单拷贝 即每个基因只出现一次 基因有连续的和间断的 有内含子 相关基因丛集 功能上相关的基因排列在一起 有重叠基因 含有不规则结构基因 基因之间无间隔区 mRNA 端无帽子结构 结构 基因本身无翻译起始序列 3 表达策略表达策略 多聚蛋白策略 按病毒基因组的 5 3 方向进行翻译 形成一个大的多肽 这其中包含某种蛋白酶 再进行翻译后的切割 把一个 Polyprotein 分成几个有 功能的多肽 该策略在马铃薯 Y 病毒科的病毒中普遍存在 多聚蛋白的策略能 克服非 5 端的起始密码子问题外 还能使几个功能蛋白同时表达 更加容易调 节整个生化途径 亚基因组 RNA 策略 亚基因组 RNAs sgRNA 是在病毒的复制过程中从基 因组 RNA 上合成的具有截短的 5 端和共同的 3 端的基因组分 原来在下游的编 码框就变成 mRNA 的 5 末端 当在基因组的 3 末端有几个基因存在时 一系列 具有共同 3 末端的 sgRNA 产生 中间起始策略 翻译不是从 5 端的 AUG 启动子开始的 而是起始于中间的核 糖体进入位点 IRES 或核糖体着陆点 IRES 形成一个复杂的二级或三级结构 以使核糖体和激活因子结合 略读策略 40S 核糖体亚基开始从 RNA 的 5 端开始扫描 但是并不是所有的 都从第一个 AUG 开始翻译的 有时会略过第一个 AUG 从后面的 AUG 开始 起始翻译 在有些情况下 40S 核糖体亚基在终止密码子的位置不离开 RNA 链 又重新开始寻找下一个起始密码子 多分体基因组策略 多分体基因组病毒在病毒的复制循环中需要把基因组分 成几个核酸片断 DNA 病毒和 RNA 病毒中都存在这方面的情况 对于正意的 ssRNA 病毒来说 这个策略可以把基因放在每一个 RNA 片断的 5 末端并能直 接翻译成蛋白产物 在 70 个植物病毒属中 28 个有多组分基因组 4 病毒基因组的非编码区的末端结构病毒基因组的非编码区的末端结构 植物病毒的 ssRNA 基因组在其 5 或 3 末端形成特殊结构 1 5 端帽子 cap 结构 2 5 连接蛋白 3 3 端 Poly A 结构 4 3 端类似 tRNA 结构 5 互补的 5 和 3 序列 第五讲第五讲 1 1 RNARNA 病毒复制方式病毒复制方式 ssRNA ssRNA 病毒的复制病毒的复制 ssRNA 病毒进入寄主后释放出 RNA 其 5 端结合到寄 主的核糖体上 它与寄主核糖体的亲和力比寄主的 mRNA 大 1000 倍 RNA 释放 并不是一下完成的 而是从 5 端逐渐向外释放 然后顺 5 3 来进行翻译 先 翻译出 RNA 聚合酶 RdRp 及其它病毒专化蛋白 再从 3 端开始复制整个基 因组形成负链 再在负链上合成正链 最后外壳蛋白亚基和 RNA 链组装成新的 病毒粒体 聚集在细胞质中 ssRNA ssRNA 病毒的复制病毒的复制 植物弹状病毒具有 ssRNA 基因组 与其复制有关的蛋白 有核衣壳蛋白 N 被认为是复制酶的 1 种大蛋白 L 和基质蛋白 M 植物 弹状病毒的 ssRNA 基因组有两个功能 作为 mRNA 转录的模板以及作为复制模 板 其细胞核弹状病毒的复制过程如下 进入到细胞后 病毒与内质网 ER 结合 把核蛋白壳核心释放到细胞质 中 核蛋白壳核心经由核孔进入细胞核中 在 L 蛋白的催化下进行早期转录 形成的 mRNA 进入细胞质并翻译 核心的复制酶蛋白 N M2 和 L 进入到细胞核中 催化基因组 RNA 的复制并 进行晚期 mRNA 的转录 在细胞核的周边形成含有 N M2 和 L 蛋白的颗粒状电子浓密的病毒质体 viroplasms 病毒在此复制 在复制的晚期 M 蛋白与新合成的核蛋白核心结合并缠绕在上 该复合体 再与 G 蛋白结合 聚集在内核膜上 新合成的病毒粒体进入核的外周空间 双链双链 RNA 病毒的复制病毒的复制 细胞内的复制位点 在细胞质中复制 侵染后 在细胞质中可出现染色浓密 的病毒质体 RNA 的装配 有 2 个识别信号 其一是对病毒的基因组特异的 其二是对 10 12 条 dsRNA 分子特异的 复制 在呼肠孤病毒中 负链是在病毒质体中由病毒复制酶以正链为模板合 成的 形成的 dsRNA 最终装配成病毒粒体 2 2 病毒提纯的原则病毒提纯的原则 不同病毒往往依据提纯的目的和要求不同 设计不同的提纯方案 如 1 制作抗血清 尽量除去寄主的各种抗原成分 2 拟用于病毒核酸性质研究 尽量除去寄主的各类核酸或核酸衍生物 设计具体的提纯方案设计时 1 应查找前人资料 看是否前人资料能直接利用 2 依据提纯目的和现有实验条件对前人方法进行改进 3 依据病毒和繁殖寄主的特性创造提纯方法 从初提纯开始 每一步最好用一定的检验方法对提纯中的病毒进行监测 如血 清学检测 电镜观察 电泳分析 紫外扫描等 第六讲第六讲 1 1 植物病毒遗传变异的分子基础植物病毒遗传变异的分子基础 病毒在其生命过程中可因突变和重组产生变异 突变突变 病毒基因组核苷酸序列的任何改变被认为是一种突变 包括点突变 缺失和插入 点突变 主要发生在由于 RNA 基因组在复制过程中低的准确性 特别是在 RNA 复制过程中所涉及的酶 病毒的 RdRp 或复制酶 缺乏校正活性所致 另 一种可能的机制是称为 RNA 编辑 RNA editing 的转录后碱基的修饰过程 插入和缺失 插入可能是较长的 RNA 片段或仅几个非模板的核苷酸 通常 的情况下较长 RNA 片段的插入是由于 RNA 重组所致 而少数几个非模板核苷 酸的插入是由于在难被复制酶拷贝的模板区域 RNA 复制酶的错误所导致 缺 失常出现在缺陷干扰 RNA 中 象插入一样 缺失片段的大小从几个核苷酸到 大片段的 RNA 分子 移码突变 当缺失或插入改变通常的遗传三联体密码子时 就会在翻译过程 中发生核糖体的移码作用 突变体的稳定性 除了缺失突变外 多数突变体能够进行逆的突变 分为回 复突变和补偿突变两种类型 重组重组 两个基因组之间发生遗传物质的交换称为重组 典型 重组 这种类型的重组在 DNA 病毒以及具有 DNA 阶段的 RNA 病毒 反转录病毒 是普遍存在的 因为寄主细胞中具有 DNA 重组的系统 RNA 重组 RNA RNA 重组可发生在不同的病毒 RNA 来源于不同病毒或 同一病毒 并有同源或非同源交换体的出现 前者发生在两个几乎相同的 RNA 或几乎相同的 RNA 区域 而后者发生在不相关的 RNA 或不相同的区域 间 缺陷干扰 缺陷干扰 DI RNA 在 RNA 病毒的侵染过程中 经常伴有源于 Helper 病 毒基因组的 DI RNA 的存在 由于 DI RNA 干扰 Helper 病毒的积累 它们对于 控制 Helper 病毒的病害严重度和对 RNA 病毒进化适合性的各个方面起重要作 用 表现型混合表现型混合 2 血清学检测方法与原理血清学检测方法与原理 酶联免疫吸附法 用酶作标记物或指示剂进行抗原和抗体定性 定量 定位 测定的技术 灵敏度高 1 10ng mg 病毒 特异性强 操作简便 广泛用于 病毒的诊断和鉴定 直接法 用特异性酶标抗体直接检出样品中的抗原 间接法 用酶标记抗抗体检出抗原 双抗体夹心法 双抗体检出抗原的方法 斑点 ELISA 法 以硝酸纤维素膜作载体进行的 ELISA 法 免疫双扩散法 以琼脂糖或琼脂凝胶作为扩散反应的介质 由抗原和抗体在 介质扩散中相遇 而在某一位置上形成肉眼可见的沉淀线 免疫吸附电镜技术 将免疫与电镜技术结合 用以检测抗原和抗体特异性结 合的方法 3 双链双链 RNA 分析和核酸鉴定技术分析和核酸鉴定技术 双链 RNA 技术 植物基因组很少存在 dsRNA 即使存在 其分子量很小 而 RNA 侵染病毒后 在植物中都存在较大分子量的 dsRNA 分子量 1 106 因此 检测植物中 dSRNA 存在 可以确定植物是否受到 RNA 病毒的侵染 对 于判断是否是 RNA 病毒侵染的有效检测方法 PCR 技术 在模板指导 引物引导 聚合酶催化的 DNA 特异片段的周期性 体外扩增反应 原理和程序 模板 DNA 引物 人工合成的 DNA 片段 15 30bp 周期性扩增 变性 94 95 退火 37 60 延伸 72 第七讲第七讲 MP 的十大特性 的十大特性 由于是一种非结构蛋白 MP 不包装在病毒粒体中 有些病毒的细胞间运动要 求 CP 的参与 即使在这种情况下 MP 也独立于病毒粒体之外 但 PVY 是个例 外 因为它的 CP 具有 MP 的一些性状 MP 一般不参与病毒的复制过程 例如 CaMV 基因 I 编码 MP 的突变体可在 原生质中复制 但不能在病株内扩展 MP 有同源的序列 在 TMV 的 MP 发现之后 几种其它病毒的 MP 也被发现有序 列的同源性 病毒 MP 常常是暂时的表达 通常是在侵染的早期表达而在侵染后期下降 TMV MP 的表达时间而不是表达量是运动的关键 MP 是一类核酸结合蛋白 它们必须转运病毒核酸通过 PD 来完成其功能 一 些 MP 促进病毒粒体通过 PD 而另一些以非病毒粒体的形式协助核酸的运输 对后一种形式来说 MP 必须是核酸结合蛋白 MP 一般不是病毒专化的 许多的 MP 被确定为是非专化的核酸结合蛋白 一 种不能在细胞间运动的病毒当接种另一种有运动能力的病毒 辅助病毒 后 就可获得运动能力 MP 通常定位在 PD PD 定位作用对于 TMV MP 的功能是关键的 缺乏这种过程 的突变体就丧失了细胞间运动能力 MP 可修改 PD SEL 病毒要在细胞间的扩展就必需经过 PD 由于 PD 的 SEL 小 于病毒的核酸或病毒粒体 MP 必需增加 SEL 使病毒核酸得以通过 MP 可通过 PD 运动 已有许多证据显示病毒的 MP 可穿过 PD MP 促进核酸通过 PD 的运动 由于 MP 具有结合核酸和通过 PD 的能力 这就 是 MP 促进病毒 DNA 或 RNA 在细胞间运动的原因 第八讲第八讲 1 植物病毒的传播方式植物病毒的传播方式 植物病毒的传播按照在传播中的关系和作用分为两大类 非介体传播 在病毒传递中没有其他有机体介入的传染方式 介体传播 在病毒传递中有其他有机体介入的传播方式 这种有机体被称为 介体 Vector 包括昆虫 线虫 真菌 菟丝子等 非介体传播 机械传播 无性繁殖材料传播 嫁接传播 菟丝子传播 种 子和花粉传播 介体传播 在传毒介体中 昆虫是最主要的介体 其中 70 为同翅目的蚜虫 叶蝉和飞虱 而又以蚜虫为最主要的介体 大部分昆虫传毒的资料来于蚜虫传 毒 此外 土壤存在的介体主要有线虫和真菌 线虫介体 真菌介体 螨类介体 昆虫介体 2 分类依据 分类依据 病毒粒体特性 形态 基因组特性 蛋白质特性 脂膜有无等 基因组结构和复制特性 基因组结构 核酸复制策略 转录特征 蛋白加工 特性等 病毒抗原性质 血清学关系和抗原决定簇定位 生物学特性 寄主范围 致病性 传播途径 地理分布等 3 持久性传播 持久性传播 介体从病株上获毒取食的时间很长 从 10min 到 2h 取食时间 愈长 传毒效率愈高 病毒在昆虫体内