高中生物《植物组织培养技术》教案1 苏教版选修1

用心 爱心 专心1 植物组织培养教案植物组织培养教案 一 本课程的性质 地位和作用一 本课程的性质 地位和作用 植物组织培养是以植物细胞 组织 器官为研究对象 运用工程学原理 利用人工培 养基按照预定目标 对植物的器官 组织 细胞和原生质体进行培养 改变生物性状 生 产生物产品 为人类生产和生活服务的一门综合性技术科学 也是现代生物技术的核心技 术之一 在植物的优良品种快速繁殖 脱毒苗木生产 缩短育种进程 种质资源保存等方 面具有其它技术无法比拟的优势 它的主要研究内容是研究在无菌及离体条件下 细胞 组织 器官所需营养条件和环 境条件 细胞 组织 器官的形态发育规律 植物材料的快速大量繁殖方法 原生质体融 合方法与机理 再生个体的遗传变异 种质资源的离体保存机理与方法 通过植物细胞工 程实现对动植物的遗传改造 创造新的生物种质 为人类造福 二 教学目的及要求二 教学目的及要求 了解植物组织培养的发展概况 发展现状 未来发展趋势及在生产实践中应用 理解植物组织培养的基本原理 了解植物组织培养实验室或商业性种苗生产企业的设计与构建 熟悉培养室常用仪 器 设备及用具 并掌握其使用方法 熟知组织培养实验室常用药品 并掌握其性质 用 途及配制方法 了解植物组织培养中如洗涤 灭菌 培养基配制 无菌操作等技术环节 并掌握其 操作规程 会熟练操作 了解影响植物组织培养的环境条件 掌握植物器官 愈伤组织 胚胎 花药与花粉 细胞 原生质体培养及种质资源保 存的基础技术 掌握植物组培快繁及脱毒苗培育技术 熟知外植体初代培养 诱导增殖 壮苗与生 根及瓶苗驯化等各技术环节 并了解组织培养中污染 褐变及超度含水态苗发生的原因及 控制措施 了解重要植物的组培快繁与脱毒技术及组培苗工厂化生产与经营管理 三 内容与课时安排三 内容与课时安排 36 36 学时学时 章 节 目 录 课堂讲授内容及学时分配表 章章 节节内内 容容学学 时时 概述概述 2 2 第第 1 1 章章植物组织培养实验室的构建和操作技术植物组织培养实验室的构建和操作技术 7 7 用心 爱心 专心2 第第 2 2 章章愈伤组织培养愈伤组织培养 3 3 第第 3 3 章章器官培养器官培养 3 3 第第 4 4 章章胚胎培养胚胎培养 3 3 第第 5 5 章章花药和花粉培养花药和花粉培养 3 3 第第 6 6 章章细胞培养细胞培养 3 3 第第 7 7 章章原生质体培养和体细胞杂交原生质体培养和体细胞杂交 3 3 第第 8 8 章章植物脱毒技术植物脱毒技术 3 3 第第 9 9 章章常见植物的脱毒与快繁技术常见植物的脱毒与快繁技术 4 4 第第 1010 章章组培苗工厂化生产的经营与管理组培苗工厂化生产的经营与管理 1 1 第第 1111 章章种质保存种质保存 1 1 0 0 概概 述 述 2 2 学时 学时 一 植物组织培养的概念 二植物组织培养的发展 三植物组织培养的应用 本章小结 目的要求 1 掌握组织培养的概念和类型 2 掌握组织培养的特点 3 了解组织培养发展史 4 初步掌握组织培养在农业实践上的应用 一 植物组织培养的概念一 植物组织培养的概念 一 植物组织培养的概念 高等植物的组织培养 tissue culture 技术是指分离一个或数个体细胞或植物体的 一部分在无菌条件下培养的技术 通常我们所说的广义的组织培养 是指通过无菌操作分 离植物体的一部分 即外植体 explant 接种到培养基上 在人工控制的条件进行培养 使其生成完整的植株 二 植物组织培养的生理依据 细胞全能性 cell totipotency 植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组 并具有发育成为完整植株的潜在能力 植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具有关键性作用 它包括 生长素 类 细胞分裂素类 赤霉素 脱落酸 乙烯等 用心 爱心 专心3 生长素类主要用于愈伤组织的形成 体细胞胚的产生及试管苗的生根 常用的有 2 4 D NAA IBA IAA 等 其作用强弱为 2 4 D NAA IBA IAA 细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化 延迟组织的衰老 促进芽的产生等作用 常用的有 Zip KT 6 BA ZT 等作用强弱顺序为 Zip KT 6 BA ZT 赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长 打破种子休眠的作用 常用的为 GA3 三 植物组织培养的类型 组织培养按培养对象可分为组织或愈伤培养 器官培养 植株培养 细胞和原生质体 培养等 1 组织或愈伤组织培养 tissue callus culture 为狭义的组织培养 是对植物体 的各部分组织进行培养 如茎尖分生组织 形成层 木质部 韧皮部 表皮组织 胚乳组 织和薄壁组织等等 或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养 二者均通过再分化诱 导形成植株 2 器官培养 organ culture 即离体器官的培养 根据作物和需要的不同 可以包 括分离茎尖 茎段 根尖 叶片 叶原基 子叶 花瓣 雄蕊 雌蕊 胚珠 胚 子房 果实等外植体的培养 3 植株培养 plant culture 是对完整植株材料的培养 如幼苗及较大植株的培养 4 细胞培养 cell culture 是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较 好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养 5 原生质体培养 protoplast culture 是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的 培养 组织培养是本世纪发展起来的一门新技术 由于科学技术的进步 尤其是外源激素的 应用 使组织培养不仅从理论上为相关学科提出了可靠的实验证据 而且一跃成为一种大 规模 批量工厂化生产种苗的新方法 并在生产上越来越得到广泛的应用 植物组织培养之所以发展如此之快 应用的范围如此之广泛 是由于具备以下几个特 点 培养条件可以人为控制 组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长 摆脱了大自然中四季 昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响 且条件均一 对植物生长 极为有利 便于稳定地进行周年培养生产 生长周期短 繁殖率高 植物组织培养是由于人为控制培养条件 根据不同植物不同部位的不同要求而提供不 同的培养条件 因此生长较快 另外 植株也比较小 往往 20 30d 为一个周期 所以 虽 然植物组织培养需要一定设备及能源消耗 但由于植物材料能按几何级数繁殖生产 故总 体来说成本低廉 且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗 管理方便 利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下 人为提供一定的温度 光照 湿度 营养 激素等条件 极利于高度集约化和高密度工厂化生产 也利于自动化控制生产 它是未来 农业工厂化育苗的发展方向 它与盆栽 田间栽培等相比省去了中耕除草 浇水施肥 防 治病虫害等一系列繁杂劳动 可以大大节省人力 物力及田间种植所需要的土地 二二 植物组织培养的发展 植物组织培养的发展 用心 爱心 专心4 植物组织培养的研究可以追溯到 20 世纪初期 根据其发展情况 大体可以分为三个时 期 1 萌芽阶段 组织培养技术的蓬勃发展只是近 50 年的事 但它的整个历史可以追溯至 19 世纪末和 上世纪初 20 世纪初 在 Schleiden 和 Schwann 所发展起来的细胞学说的推动下 1902 年 德国植物学家 Haberlandt 提出了高等植物的器官和组织为许多细胞组成的观点 以及植物 细胞全能性的理论 即植物的体细胞 在适当的条件下 具有不断分裂和繁殖 发育成完 整植株的潜在能力 他首次发表了植物离体细胞培养实验的报告 1912 年 Habefiandt 的 学生 Kotte 和美国的 Robins 在根尖培养中获得了组织培养的成功 Kotte 采用了无机盐 葡萄糖 蛋白胨 天冬酰胺 及添加各种氨基酸的培养基 Robins 用含无机盐 葡萄糖或 果糖的琼脂培养基 培养了长度为 1 45 3 75cm 的豌豆 玉米和棉花的茎尖 形成了一些 缺绿的茎和根 2 奠基阶段 自 Haberlandt 的实验之后 直到 1934 年美国的 White 由番茄根建立了第一个活跃生 长的无性繁殖系 并反复转移到新鲜培养基中继代培养 使根的离体培养实验获得了真正 的成功 并在以后 28 年间培养了 1600 代 这之后 White 又以小麦根尖为材料 研究了 光 温度 通气 pH 值 培养基组成等各种培养条件对生长的影响 并于 1937 年建立了 第一个组织培养的综合培养基 其成分均为已知化合物 包括 3 种 B 族维生素 即吡哆醇 硫胺素和烟酸 该培养基后来被定名为 White 培养基 与此同时 Gautherer 1934 在研 究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中 提出了 B 族维生素和生长素对组织培养的重 要意义 并于 1939 年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功 同年 White 由烟草种间杂 种的瘤组织 Nobecourt 由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的组织培养物 因此 Gautherer White 和 Nobecourt 一起被誉为组织培养学科的奠基人 我们现在所用的培养 方法和培养基 基本上都是由这三位科学家建立的 后来 White 于 1943 年发表了 植物 组织培养手册 专著 使植物组织培养开始成为一门新兴的学科 3 快速发展和应用阶段 40 年代 Skoog 和崔徵在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现 腺嘌呤或腺 苷可以解除培养基中生长素 IAA 对芽形成的抑制作用 而能诱导形成芽 从而明确了腺 嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一 即这一比例高时 产生芽 这一 比例低时 则形成根 相等则不分化 在寻找促进细胞分裂的物质过程中 Miller 等人于 1956 年发现了激动素 不久即知道激动素可以代替腺嘌呤促进发芽 并且效果可增加 3 万 倍 结果上述控制器官分化的激素模式变为激动素与生长素的比例关系 这方面的成功发 现 有力地推动了植物组织培养的发展 1952 年 Morel 和 Martin 通过茎尖分生组织的离体培养 从已受病毒侵染的大丽花中 首次获得无病毒植株 1935 1945 年 Muir 把单细胞放在一张铺在愈伤组织上面的滤纸上 培养 使细胞发生了分裂 即实施了看护接种技术 使单细胞培养获得初步成功 1960 年 Cocking 等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功 1971 年 Takebe 等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株 这不仅在理论上证明了无壁的原生质体同样 具有全能性 而且在实践上为外源基因的导入提供了理想的受体材料 80 年代中期以来 对禾谷类作物的原生质体培养也相继告捷 在这方面中国学者做出了重要贡献 1962 年印 度 Guha 等人成功地在毛叶曼陀罗花药培养中 由花粉诱导得到单倍体植株 从而促进了花 药和花粉培养的研究 用心 爱心 专心5 以后相继在烟草 水稻 小麦 玉米 番茄 辣椒 草莓 苹果等多种植物培养中获 得成功 其数目达到 160 多种 其中烟草 水稻和小麦等的花药育种培养在中国取得了引 入注目的成就 1960 年 Morel 提出了一个离体无性繁殖兰花的方法 其繁殖系数极高 由于这一方 法有很大的应用价值 很快被兰花生产者所采用 迅速建立起兰花工业 1973 年 Carlson 等通过两个烟草物种之间原生质体融合 获得了第一个体细胞杂种 Cocking 等倡导的原 生质体培养和体细胞杂交 研究得到了迅速发展 已经能使矮牵牛和烟草属的杂种细胞增 殖分化生成杂种植株 在整个植物组织培养发展的历史中 我国学者做出多方面的贡献 除了前述的崔徵的 研究成效以外 还有 1993 年李继侗等关于玉米等植物离体根尖培养的研究工作 以及罗士 韦关于幼胚和茎尖培养 李正理关于离体胚的研究培养 王伏雄等关于幼胚的研究培养工 作 三 植物组织培养的应用三 植物组织培养的应用 植物组织培养成为生物科学的一个广阔领域 除了在基础理论的研究上占有重要地位 以外 还在农业生产中也得到越来越广泛的应用 一 植物组织培养的快速繁殖 用植物组织培养的方法进行快速繁殖 rapidpropagation 是生产上最有潜力的应用 包括花卉观赏植物 蔬菜 果树 大田作物及其他经济作物 快繁技术不受季节等条件的 限制 生长周期短 而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖 快速繁殖可用下列手段进行 通过茎尖 茎段 鳞茎盘等产生大量腋芽 通过根 叶 等器官直接诱导产生不定芽 通过愈伤组织培养诱导产生不定芽 试管快速繁殖应用在下 列生产或研究中 1 繁殖杂交育种中得到的少量杂交种 以及保存自交系 不育系 等 2 繁殖脱毒培养得到的少量无病毒苗 3 繁殖生产上急需的或种源较少的种苗 由于组 织培养周期短 增殖率高及能全年生产等特点 加上培养材料和试管苗的小型化 这就可 使有限的空间培养出大量的植物 在短期内培养出大量的幼苗 组织培养突出的优点是 快 通过这一方法在较短时期内迅速扩大植物的数量 以一个茎尖或一小块叶片为基 数 经组织培养一年内可增殖到 10 000 100 000 株 二 脱毒 植物在生长过程中几乎都要遭受到病毒病不同程度的危害 有的种类甚至同时受到数 种病毒病的危害 尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖 若蒙受病毒病 代代相传 越 染越重 甚至会造成极严重的后果 自从 Morell952 年发现采用微茎尖培养方法可得到无 病毒苗 virus free 后 微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一 若再与热处 理相结合 则可提高脱毒培养的效果 对于木本植物 茎尖培养得到的植株难以发根生长 则可采用茎尖微体嫁接的方法来培育无病毒苗 组织培养无病毒苗的方法已在很多作物的常规生产上得到应用 如马铃薯 甘薯 草 莓 苹果 香石竹 菊花等 而且已有不少地区建立了无病毒苗的生产中心 这对于无病 毒苗的培养 鉴定 繁殖 保存 利用和研究 形成了一个规范的系统程序 从而达到了 保持园艺植物的优良种性和经济性状的目的 三 体细胞无性系变异和新品种培育 breeding 植物组织培养过程中往往存在大量的变异 这种变异称为体细胞无性系变异 具有如 下特点 用心 爱心 专心6 1 变异的无方向性 既有有利的变异 也有有害的变异既有形态变异 也有生理变异 2 变异的普遍性 变异在组织培养中经常发生 出现在组织培养的各个时期 既有数 量性状变异 又有质量性状变异 既有农艺性状变异 又有经济性状变异 既有表型变异 又有生理变异 与自然变异与辐身诱变相比 体细胞无性系变异广泛而普遍 且易于获得 纯合个体 3 植物体细胞无性系变异的类型 一类为可遗传变异 主要是由于遗传物质的变化引 起的 尤以基因突变为主 另一类是不可遗传的变异 为生理型变异 往往是由于培养 过程中外加的激素及其它化学物质的刺激引起 如叶形 育性等 4 引起植物体细胞无性系变异的原因 激素的刺激为主要原因 高浓度的 GA 和 IAA 会造成畸形胚的高频发生 TDZ 可使植株产生白化苗或玻璃化植株 2 4 D 则使培养 细胞发生染色体数量变化 随培养时间的延长 染色体变异频率升高 变异的性状和范围 手扩大 5 植物体细胞无性系变异的利用价值及途径 它是一种重要的遗传变异来源 是一种 重要的遗传资源 对于育种有重要的应用价值 四 单倍体育种 花药 花粉的培养在苹果 柑橘 葡萄 草莓 石刁柏 甜椒 甘蓝 天竺葵等约 20 种园艺植物得到了单倍体植株 在常规育种中为得到纯系材料要经过多代自交 而单倍体 育种 经染色体加倍后可以迅速获得纯合的二倍体 大大缩短了育种的世代和年限 五 种质保存 用植物组织培养技术保存种质具有以下优点 1 在较小的空间内可以保存大量的种质资源 2 具有较高的繁殖系数 3 避免外界不利气候及其他栽培因素的影响 可常年进行保存 4 不爱昆虫 病毒和其他病原体的影响 5 有利于国际间的种质交换与交流 六 遗传转化 大多数植物遗传转化方法需要通过植物组织培养来进行 本章小结本章小结 1 植物组织培养是指分离单个或多个细胞或植物体的一部分 在人工配制的培养 基上进行培养 使之长成一株完整植物体的过程 2 按照外植体的不同 组织培养可分为植株培养 胚胎培养 器官培养 细胞培养 和原生质体培养 5 种类型 3 组织培养具有 培养条件可以人为控制 生长周期短 繁殖率高 管理方便 利于工厂化生产的突出特点 因而发展迅速 4 组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个方面 快速繁殖优良苗 木 获得脱毒苗 育种上应用 工厂化育苗 第第 1 1 章章 植物组织培养实验室的构建和操作技术 植物组织培养实验室的构建和操作技术 7 7 学时 学时 用心 爱心 专心7 第一节商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 第二节培养基及其配制 第三节外植体的选择与培养 第四节试管苗的驯化与移载 本章小结 目的要求 目的要求 1 掌握组织培养实验室的设计 2 掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法 3 掌握调控组织培养的主要环境条件 4 掌握灭菌和消毒的区别 5 掌握灭菌的不同方法和具体操作过程 6 掌握无菌接种的步骤 7 掌握外植体的培养方法和步骤 8 一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法 9 掌握试管苗驯化的基本程序 在进行植物组织培养工作之前 首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面 的了解 以便因地制宜地利用现有房屋 或新建 改建实验室 实验室的大小取决于工作 的目的和规模 以工厂化生产为目的 实验室规模太小 则会限制生产 影响效率 在设 计组织培养实验室时 应按组织培养程序来设计 避免某些环节倒排 引起日后工作混乱 植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的 要做到无菌的条件 需要一定的设备 器材 和用具 同时还需要人工控制温度 光照 湿度等培养条件 第一节第一节 商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 一 设计一 设计 一个标准的组织培养实验室应当包括 洗涤室 配置室 无菌室 培养室 观察室等 在实际中可结合可行条件 合并一部分 一 洗涤室 cleaning room 洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗 干燥和贮存 室内应配备大型水槽 最好是 白瓷水槽 为防止碰坏玻璃器皿 可铺垫橡胶 上下水道要畅通 备有塑料筐 用于运输 培养器皿 备有干燥架 用于放置干燥涮净的培养器皿 二 准备室 repairing room 准备室要求明亮 通风 在准备室内要完成培养基制备以及试管苗出瓶 清洗与整理 工作 如果房间较多 可将准备室分为洗涤室和配置室两部分 洗涤室专门负责试管苗出 瓶与培养器皿的清洗工作 配置室则负责培养基的配制 分装 包扎和高压灭菌等工作 三 缓冲室 进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服 拖鞋 戴上口罩 应当在此室内 安装灭菌用的紫外灯 控制无菌室及培养室的配电板等 四 无菌操作室 transfering room 用心 爱心 专心8 接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室 其无菌条件的好 坏对组织培养成功与否起重要作用 在工作方便的前提下 接种室宜小不宜大 一般 7 8m2 要求地面 天花板及四壁尽 可能密闭光滑 易于清洁和消毒 配置拉动门 以减少开关门时的空气扰动 接种室要求干爽安静 清洁明亮 在适当位置吊装 1 2 盏紫外线灭菌灯 用以照射灭 菌 最好安装一小型空调 使室温可控 这样可使门窗紧闭 减少与外界空气对流 五 培养室 culturing room 培养室是将接种的材料进行培养生长的场所 培养室的大小可根据需要培养架的大小 数目 及其他附属设备而定 其设计以充分利用空间和节省能源为原则 高度比培养架略 高为宜 周围墙壁要求有绝热防火的性能 培养材料放在培养架上培养 培养架大多由金属制成 一般 设 5 层 最低一层离地高 约 l0cm 其他每层间隔 30cm 左右 培养架即高 1 7m 左右 培养架长度都是根据日光灯的 长度而设计 如采用 40W 日光灯 则长 1 3m 30W 的长 lm 宽度一般为 60cm 培养室最重要的因子是温度 一般保持在 20 27 左右 具备产热装置 并安装窗式 或立式空调机 由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度 最好不同种类有不同 的培养室 室内湿度也要求恒定 相对湿度以保持在 70 80 为好 可安装加湿器 控制日光照时间可安装定时开关钟 一般需要每天光照 10 16h 也有的需要连续照明 短日照植物需要短日照条件 长日照 植物需要长日照条件 现代组培实验室大多设计为采 用天然太阳光照作为主要能源 这样不但可以节省能源 而且组培苗接受太阳光生长良好 驯化易成活 在阴雨天可用灯光作补充 六 驯化室 驯化室要求清洁无菌 配有空调机 加湿器 恒温恒湿控制仪 喷雾器 光照调节装 置 通风口以及必要的杀菌剂 七 温室 应配有空调机 通风口 加湿器 恒温恒湿控制装置 喷雾装置 光照调节装置以及 必要的杀菌杀虫装置及相应药剂 二 仪器设备和器皿用具二 仪器设备和器皿用具 一 仪器设备 见实验室设计 1 超净台 优点是操作方便自如 比较舒适 工作效率高 准备时间短 开机 10 分 钟即可操作 可进行长时间使用 在工厂化生产中 接种工作量很大 需要经常长久地工 作时 超净台是很理想的设备 超净台功率在 145 260W 左右 它装有小型鼓风机 使空 气穿过一个前置过滤器 在这里把大部分空气尘埃先过滤掉 然后再使空气穿过一个细致 的高效过滤器 它除去了大于 0 3um 的尘埃 细菌和真菌孢子等 最后以较洁净的气流吹 到工作台面 超净空气的流速为每分钟 24 30m 这已足够防止附近空气袭扰而引起的污 染 这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒 在这样的无菌条件下操作 就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染 超净台分水平式和垂直式二种型号 2 无菌箱 在投资少的情况下 可以用接种箱来代替超净台 接种箱依靠密闭 药剂 熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌 但操作活动受限制 准备时间长 工作效率低 3 空调机 保证室内温度 一般为 25 2 应安置在室内较高的位置 以便于排热 散凉 用心 爱心 专心9 4 除湿机 培养室的湿度应为 70 80 湿度过高易长杂菌 湿度过低培养器皿内的 培养基会失水变干 影响培养物的生长 5 恒温箱 用于植物材料的培养 可以控制温度 湿度及光照等 6 烘箱 用于干燥洗净的玻璃器皿 也可用于干热灭菌和测定干物重 用于干燥需保 持 80 100 进行干热灭菌需保持 150 达 1 3h 若测定干物重 则温度应控制在 80 烘干至完全干燥为止 7 高压灭菌锅 用于进行培养基和器械用具的灭菌 小规模实验室可选用小型手提式 高压灭菌锅 如果是连续的大规模生产 应选用大型立式的或卧式的高压灭菌锅 通常以 电作能源 8 冰箱 主要用于贮存母液 各种易变质 易分解的化学药品以及植物材料等 9 电子分析天平和托盘天平 电子分析天平 用于称取大量元素 微量元素 维生素 激素等微量药品精确度为 0 0001g 托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等 其精确度 为 0 1g 天平应放置在干燥 不受震动的天平操作台上 10 显微镜及解剖镜 种类较多 用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜 双筒解剖 镜在分离茎尖等较小组织时 便于观察 操作 通常放大 5 80 倍 放大 40 倍以上操作需 要有相当熟练的技术和较好的工具 为进行操作 要有照明装置 解剖镜上带有照相装置 根据需要随时对所需材料进行摄影记录 11 水浴锅 用于溶解难溶药品和熔化琼脂条 12 摇床与转床 用于改善液体培养材料的通气状况及促进酶解原生质体的解离 一 般在液体培养中转速为每分钟 100 次左右 在解离原生质体时为每分钟 80 左右 13 磁力搅拌器 磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质 如各种化学物质 琼脂粉等 磁力搅拌器还可加热 使之更利于溶解 14 电蒸馏水器 电蒸馏水器 采用硬质玻璃或金属制成 蒸馏水用于配制母液或培 养基 配制培养基可用自来水来代替 若实验要求严格的话 则须用蒸馏水 15 酸度计 组织培养中培养基 pH 值的准确度是十分重要的 应当使用酸度计 若无 酸度计 也可使用 pH 试纸进行粗测 首次使用酸度计前 应用标准液调节定位 然后固定 测量 pH 值时 待测液必须充分 搅拌均匀 如果培养基温度过高 测量时要调整 pH 值计上的温度扭使之和培养基温度相当 注意保护好玻璃电极 用后电极应用蒸馏水冲洗净 盖上电极帽 16 离心机 用于收集原生质体 转速要求较低 一般为 1000 4000rpm 即可 二 各类器皿 1 培养器皿 在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿 要求由碱性溶 解度小的硬质玻璃制成 以保证长期贮存药品及培养的效果 培养用的还要求透光度好 能耐高压高温 能方便放人培养基和培养材料的器皿 根据培养的目的和要求 可以采用 不同种类 规格的玻璃器皿 其中以试管 三角瓶 培养皿等使用较多 最常使用的是三角瓶 规格有 l00ml 250ml 500ml 等 一般使用 l00ml 三角瓶 无 论静止或振荡培养皆适用 其培养面积大 利于组织生长 受光也比试管好 由于瓶口较 小 亦不易污染 培养皿常用 9 12cm 直径等规格 要求上 下能密切吻合 这在游离细胞 原生质体 花粉等的静置培养 看护培养 无菌种子的发芽 植物材料的分离等都需采用 用心 爱心 专心10 试管常用 18mmXl80mm 或 20mmX200mm 规格 可用于培养较高的试管苗 另外也不易污 染 培养器皿还可就地取材 采用一些代用品 工厂化生产可采用广口的 200ml 罐头瓶 加盖半透明的塑料盖 由于瓶口大 所以大量繁殖时操作方便 工作效率高 也减少了培 养材料的损伤 但缺点是易引起污染 目前 培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所代替 塑料容器具有 质轻 透明 不易破碎 成本低等优点 如培养容器多为平底方盒形 可提高培养空间利 用率的植株数 并能一层层地叠摞起来 从而节约空间 这类塑料制品多是采用聚丙烯材 料制成 能耐高温 可进行高压灭菌 有些产品为一次性消耗品 不但可节省洗涤人工 还可节省时间 提高效率 一次性塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶 无须另外配盖 使用时 比较方便 瓶口封塞可用多种方法 要具有一定的通气性和密闭性 以防止培养基干燥和杂菌污 染 以前封口常用棉塞 但这种封口办法夏季极易污染 且不易保持培养基的湿度 现在 多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口 以线绳结扎或橡皮圈箍扎 为了增加通气性 可在里面 衬一层硫酸纸或牛皮纸 这样经济方便 且通气好 也可采用专用的封口膜 2 分注器 小型操作时可采用烧杯直接分装 大型实验室可采用医用 下口杯 作为 分装工具 在 下口杯 的下口管上套一段软胶管 加一弹簧止水夹 使用时非常合适 更大规模或要求更高效率时 可考虑采用液体自动定量灌注设备 3 离心管 用于离心收集原生质体 一般用 5ml 10ml 规格 4 刻度移液管 常用的有 0 1ml 0 2ml 0 5ml 2ml 5ml 10ml 用于配制培养基 时吸取不同种类的母液 应多准备几支 分开使用 5 细菌过滤器 用于除去不能采用湿热灭菌法的液体中的细菌 一般采用 0 22um 微 孔滤膜进行抽滤灭菌 包括滤头 注射器或采用抽滤装置 真空泵 吸滤瓶 滤气玻璃管 等 6 实验器皿 在组织培养中配制培养基 贮藏母液 材料的消毒等需要各种化学实验 用的玻璃器皿 包括 100ml 250ml 500ml 1000ml 烧杯 l0ml l00ml 1000ml 量筒 l00ml 1000ml 试剂瓶 棕色 等等 三 器械用具 1 镊子类 forceps 常应用医疗上的镊子 根据操作需要有各种类型 若用 l00ml 的三角瓶作为培养瓶 可用 20em 长的镊子 镊子过短 容易使手接触瓶口 造成污染 镊子太长 使用起来不灵 活 如在分离茎尖幼叶时 则用钟表镊子 2 剪刀类 scissors 可采用医疗五官科用的中型剪刀 主要用于切断茎段 叶片等 也可以用弯形剪刀 由于其头部弯曲 可以深入到瓶口中进行剪切 3 解剖刀 切割较小材料和分离茎尖分生组织时 可用解剖刀 刀片要经常调换 使之保持锋利 状态 否则切割时会造成挤压 引起周围细胞组织大量死亡 影响培养效果 4 解剖针 解剖针可深入到培养瓶中 转移细胞或愈伤组织 也可用于分离微茎尖的幼叶 可以 自制 用心 爱心 专心11 5 接种工具 包括接种针 接种钩及接种铲 由白金丝或镍丝制成 6 钻孔器 用于取肉质茎 块茎 肉质根内部的组织时采用 一般为 T 字型 口径有各种规格 7 其它 包括酒精灯 电炉 试管架 搪瓷盘等多种 第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制 目的要求 目的要求 1 一般掌握培养基的种类 特点 2 掌握基本培养基的配方 3 一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量 4 掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤 5 熟练掌握培养基的灭菌方法 6 一般掌握培养基的筛选办法 培养基 culture medium 是植物组织培养的重要基质 在离体培养条件下 不同种 植物的组织对营养有不同的要求 甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同 只有满足了它们各自的特殊要求 它们才能很好地生长 因此 没有一种培养基能够适合 一切类型的植物组织或器官 在建立一项新的培养系统时 首先必须找到一合适的培养基 培养才有可能成功 在植物组织培养历史进程中 事实上也紧密地伴随着培养基的研制史 对植物的营养要求的不断认识 对已有培养基的改进 或者将新发现的植物激素 新的有 益成分应用于培养基之中 都大大促进了组织培养研究的迅速发展 取得越来越多的成功 一 培养基的成分一 培养基的成分 培养基的成分主要可以分水 无机盐 有机物 天然复合物 培养体的支持材料等五 大类 1 水 水是植物原生质体的组成成分 也是一切代谢过程的介质和溶媒 它是生命活动过程 中不可缺少的物质 配制培养基母液时要用蒸馏水 以保持母液及培养基成分的精确性 防止贮藏过程发霉变质 大规模生产时可用自来水 但在少量研究上尽量用蒸馏水 以防成 分的变化引起不良效果 2 无机元素 inorganicelement 大量元素 指浓度大于 0 5mmol L 的元素 有 N P K Ca Mg S 等 其作用是 1 N 是蛋白质 酶 叶绿素 维生素 核酸 磷脂 生物碱等的组成成分 是生命 不可缺少的物质 在制备培养基时以 N03 N 和 NH4 N 两种形式供应 大多数培养基既含有 NO N 又含 NH4 N NH4 N 对植物生长较为有利 供应的物质有 KN03 NH4NO3 等 有时 也添加氨基酸来补充氮素 2 P 是磷脂的主要成分 而磷脂又是原生质 细胞核的重要组成部分 磷也是 ATP ADP 等的组成成分 在植物组织培养过程中 向培养基内添加磷 不仅增加养分 提 用心 爱心 专心12 供能量 而且也促进对 N 的吸收 增加蛋白质在植物体中的积累 常用的物质有 KH2P04 或 NaH2P04 等 3 K 对碳水化合物合成 转移 以及氮素代谢等有密切关系 K 增加时 蛋白质合 成增加 维管束 纤维组织发达 对胚的分化有促进作用 但浓度不易过大 一般为 1 3mg L 为好 制备培养基时 常以 KCl KNO 等盐类提供 4 Mg S 和 Ca Mg 是叶绿素的组成成分 又是激酶的活化剂 S 是含 S 氨基酸和蛋 白质的组成成分 它们常以 MgS04 7H20 提供 用量为 1 3mg L 较为适宜 Ca 是构成细 胞壁的一种成分 Ca 对细胞分裂 保护质膜不受破坏有显著作用 常以 CaCl2 2H20 提供 5 微量元素 指小于 0 5mmol L 的元素 Fe B Mn Cu Mo Co 等 铁是一些氧 化酶 细胞色素氧化酶 过氧化氢酶等的组成成分 同时 它又是叶绿素形成的必要条件 培养基中的铁对胚的形成 芽的分化和幼苗转绿有促进作用 在制做培养基时不用 Fe2 S04 3 和 FeCl3 因其在 pH 值 5 2 以上 易形成 Fe OH 的不溶性沉淀 而用 FeS04 7H20 和 Na2 EDTA 结合成螯合物使用 B Mn Zn Cu Mo Co 等 也是植物组织 培养中不可缺少的元素 缺少这些物质会导致生长 发育异常现象 总之 植物必需营养元素可组成结构物质 也可是具有生理活性的物质 如酶 辅酶 以及作为酶的活化剂 参与活跃的新陈代谢 此外 在维持离子浓度平衡 胶体稳定 电 荷平衡等电化学方面起着重要作用 当某些营养元素供应不足时 愈伤组织表现出一定的 缺素症状 如缺氮 会表现出一种花色素苷的颜色 不能形成导管 缺铁 细胞停止分裂 缺硫 表现出非常明显的褪绿 缺锰或钼 则影响细胞的伸长 3 有机化合物 organic compound 培养基中若只含有大量元素与微量元素 常称为基本培养基 为不同的培养目的往往 要加入一些有机物以利于快速生长 常加入的有机成分主要有以下几类 1 碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖 葡萄糖和果糖也是较好的碳源 可支持许多 组织很好的生长 麦芽糖 半乳糖 甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用 蔗糖使用浓度 在 2 3 常用 3 即配制 1L 培养基称取 30g 蔗糖 有时可用 2 5 但在胚培养时 采用 4 15 的高浓度 因蔗糖对胚状体的发育起重要作用 不同糖类对生长的影响不 同 从各种糖对水稻根培养的影响来看 以葡萄糖效果最好 果糖和蔗糖相当 麦芽糖差 一些 不同植物不同组织的糖类需要量也不同 实验时要根据配方规定按量称取 不能任 意取量 高压灭菌时一部分糖发生分解 制定配方时要给予考虑 在大规模生产时 可用 食用的绵白糖代替 2 维生素 vitamin 这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代 谢活动 对生长 分化等有很好的促进作用 虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所 必需的维生素 但在数量上还明显不足 通常需加入一至数种维生素 以便获得最良好的 生长 主要有 Vsl 盐酸硫胺素 VD6 盐酸吡哆醇 Vpp 烟酸 VC 抗坏血酸 有时还 使用生物素 叶酸 VB2 等 一般用量为 0 1 1 0mg L 有时用量较高 Vm 对愈伤组织 的产生和生活力有重要作用 VB6 能促进根的生长 Vpp 与植物代谢和胚的发育有一定关系 Vc 有防止组织变褐的作用 3 肌醇 myo inosit0l 又叫环己六醇 在糖类的相互转化中起重要作用 通常可由 磷酸葡萄糖转化而成 还可进一步生成果胶物质 用于构建细胞壁 肌醇与 6 分子磷酸残 基相结合形成植酸 植酸与钙 镁等阳离子结合成植酸钙镁 植酸可进一步形成磷脂 参 用心 爱心 专心13 与细胞膜的构建 使用浓度一般为 l00mg L 适当使用肌醇 能促进愈伤组织的生长以及 胚状体和芽的形成 对组织和细胞的繁殖 分化有促进作用 对细胞壁的形成也有作用 4 氨基酸 aminoacide 是很好的有机氮源 可直接被细胞吸收利用 培养基中最常 用的氨基酸是甘氨酸 其他的如精氨酸 谷氨酸 谷酰胺 天冬氨酸 天冬酰胺 丙氨酸 等也常用 有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白 它们是牛乳用酶法等加工的水解产物 是 含有约 20 种氨基酸的混合物 用量在 10 1000mg L 之间 由于它们营养丰富 极易引起 污染 如在培养中无特别需要 以不用为宜 5 天然复合物 其成分比较复杂 大多含氨基酸 激素 酶等一些复杂化合物 它对 细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用 但对器官的分化作用不明显 它的成分大多 不清楚 所以一般应尽量避免使用 1 椰乳 是椰子的液体胚乳 它是使用最多 效果最大的一种天然复合物 一般使用 浓度在 10 20 与其果实成熟度及产地关系也很大 它在愈伤组织和细胞培养中有促 进作用 在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用 但茎尖组织的大 小若超过 1mm 时 椰乳就不发生作用 2 香蕉 用量为 150 200ml l 用黄熟的小香蕉 加入培养基后变为紫色 对 pH 值 的缓冲作用大 主要在兰花的组织培养中应用 对发育有促进作用 3 马铃薯 potato 去掉皮和芽后 加水煮 30min 再经过过滤 取其滤液使用 用 量为 150 200g L 对 pH 值缓冲作用也大 添加后可得到健壮的植株 4 水解酪蛋白 为蛋白质的水解物 主要成分为氨基酸 使用浓度为 100 200mg L 受酸和酶的作用易分解 使用时要注意 5 其他 酵母提取液 YE 0 01 0 05 主要成分为氨基酸和维生素类 麦芽提 取液 0 01 0 5 苹果和番茄的果汁 黄瓜的果实 未熟玉米的胚乳等 遇热较稳 定 大多在培养困难时使用 有时有效 4 植物激素 hormone 是植物新陈代谢中产生的天然化合物 它能以极微小的量影响到植物的细胞分化 分 裂 发育 影响到植物的形态建成 开花 结实 成熟 脱落 衰老和休眠以及萌发等许 许多多的生理生化活动 在培养基的各成分中 植物激素是培养基的关键物质 对植物组 织培养起着决定性作用 1 生长素类 auxin 在组织培养中 生长素主要被用于诱导愈伤组织形成 诱导根 的分化和促进细胞分裂 伸长生长 在促进生长方面 根对生长素最敏感 在极低的浓度 下 10 5 10 8mg L 就可促进生长 其次是茎和芽 天然的生长素热稳定性差 高温高 压或受光条件易被破坏 在植物体内也易受到体内酶的分解 组织培养中常用人工合成的 生长素类物质 IAA indoaceticacid 吲哚乙酸 是天然存在的生长素 亦可人工合成 其活力较低 是生长素中活力最弱的激素 对器官形成的副作用小 高温高压易被破坏 也易被细胞中 的 IAA 分解酶降解 受光也易分解 IBA indolebutyric acid 吲哚丁酸 是促进发根能力较强的生长调节物质 NAA naphthaleneaceticacid 萘乙酸 在组织培养中的起动能力要比 IAA 高出 3 4 倍 且由于可大批量人工合成 耐高温高压 不易被分解破坏 所以应用较普遍 NAA 和 IBA 广泛用于生根 并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长 用心 爱心 专心14 2 4 D 2 4 二氯苯氧乙酸 起动能力比 IAA 高 10 倍 特别在促进愈伤组织的形成 上活力最高 但它强烈抑制芽的形成 影响器官的发育 适宜的用量范围较狭窄 过量常 有毒效应 生长素配制时可先用少量 95 酒精助溶 2 4 D 可用 0 1mol L 的 NaOH 或 KOH 助溶 生长素常配成 1mgdml 的溶液贮于冰箱中备用 2 GA gibberellicacid 赤霉素 有 20 多种 生理活性及作用的种类 部位 效 应等各有不同 培养基中添加的是 GA3 主要用于促进幼苗茎的伸长生长 促进不定胚发 育成小植株 赤霉素和生长素协同作用 对形成层的分化有影响 当生长素 赤霉素比值 高时有利于木质部分化 比值低时有利于韧皮部分化 此外 赤霉素还用于打破休眠 促 进种子 块茎 鳞茎等提前萌发 一般在器官形成后 添加赤霉素可促进器官或胚状体的 生长 赤霉素溶于酒精 配制时可用少量 95 酒精助溶 赤霉素不耐热 高压灭菌后将有 70 100 失效 应当采用过滤灭菌法加入 3 细胞分裂素类 cytokinin 这类激素是腺嘌呤的衍生物 包括 6 BA 6 苄基氨基 嘌呤 Kt kinetin 激动素 Zt zeatin 玉米素 等 其中 Zt 活性最强 但非常昂贵 常 用的是 6 BA 在培养基中添加细胞分裂素有三个作用 诱导芽的分化促进侧芽萌发生长 细胞分 裂素与生长素相互作用 当组织内细胞分裂素 生长素的比值高时 诱导愈伤组织或器官 分化出不定芽 促进细胞分裂与扩大 抑制根的分化 因此 细胞分裂素多用于诱导 不定芽的分化 茎 苗的增殖 而避免在生根培养时使用 生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向 是愈伤组织 是长根还是长芽 如为 了促进芽器官的分化 应除去或降低生长素的浓度 或者调整培养基中生长素与细胞分裂 素的比例 生长调节物质的使用甚微 一般用 mg L 表示浓度 在组织培养中生长调节物质的使 用浓度 因植物的种类 部位 时期 内源激素等的不同而异 一般生长素浓度的使用为 0 05 5mg L 细胞分裂素 0 05 10mg L 5 培养材料的支持物 1 琼脂 agar 在固体培养时琼脂是最好的固化剂 琼脂是一种由海藻中提取的高 分子碳水化合物 本身并不提供任何营养 琼脂能溶解在热水中 成为溶胶 冷却至 40 即凝固为固体状凝胶 通常所说的 煮化 培养基 就是使琼脂溶解于 90 以上的热水 琼 脂的用量在 6 10g L 之间 若浓度太高 培养基就会变得很硬 营养物质难以扩散到培 养的组织中去 若浓度过低 凝固性不好 新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力 一般 琼脂以颜色浅 透明度好 洁净的为上品 琼脂的凝固能力除与原料 厂家的加工方式有 关外 还与高压灭菌时的温度 时间 pH 值等因素有关 长时间的高温会使凝固能力下降 过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解 丧失凝固能力 时间过久 琼脂变褐 也会逐渐丧 失凝固能力 加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便 通气问题易于解决 便 于经常观察研究等 但它也有不少缺点 如培养物与培养基的接触 即吸收 面积小 各种 养分在琼脂中扩散较慢 影响养分的充分利用 同时培养物排出的一些代谢废物 聚集在 吸收表面 对组织产生毒害作用 市售的各种琼脂几乎都含有杂质 特别是 Ca Mg 及其他 用心 爱心 专心15 微量元素 因此在研究植物组织或细胞的营养问题时 则应避免使用琼脂 可在液体培养 基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥 然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养 2 其他 有玻璃纤维 滤纸桥 海绵等 总的要求是排出的有害物质对培养材料没 有影响或影响较小 6 抗生物质 antibiotic 抗生物质有青霉素 链霉素 庆大霉素等 用量在 5 20mg L 之间 添加抗生物质可 防止菌类污染 减少培养中材料的损失 尤其是快速繁殖中 常因污染而丢弃成百上千瓶 的培养物 采用适当的抗生素便可节约人力 物力和时间 尤其对大量通气长期培养 效 果更好 对于刚感染的组织材料 可向培养基中注入 5 10 的抗菌素 抗生素各有其 抑菌谱 要加以选择试用 也可两种抗生素混用 但是应当注意抗生素对植物组织的生长 也有抑制作用 可能某些植物适宜用青霉素 而另一些植物却不大适应 值得提醒的是 在工作中不能以为有了抗菌素 而放松灭菌措施 此外 在停止抗生素使用后 往往污染 率显著上升 这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成的 7 抗氧化物 antioxide 植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质 接触空气中的氧气后 自动氧化或由酶类催 化氧化为相应的醌类 产生可见的茶色 褐色以致黑色 这就是酚污染 这些物质渗出细 胞外就造成自身中毒 使培养的材料生长停顿 失去分化能力 最终变褐死亡 在木本 尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重 目前还没有彻底完善的办法 只能按不同的 实际情况 加用一些药物 并适当降低培养温度 及时转移到新鲜培养基上等办法 使之 有不同程度的缓解 当然像严格选择外植体部位 加大接种数量等也应一并考虑 抗酚类 氧化常用的药剂有半胱