乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽抗氧化活性研究分析方案

个人收集整理 仅供参考 1 32 乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究 摘要 研究乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽 为进一步研究花生粕专用蛋白基料产品提供理 论基础 本研究运用单因素和正交试验方法对固态发酵制备花生蛋白肽工艺条件进行优化 其 最佳制备工艺条件为 营养盐溶液添加量 乳酸菌液添加量 下发酵 此工艺下制备地花生蛋白肽地可溶性氮浓度达到 发酵液对 二苯基苦基苯肼 自由基清除率为 羟自由基清除率为 花生蛋白肽地抗氧化活性结果显示 对超氧阴离子自由基地清除率是 对铁离子和铜离子螯合率分别为 和 对脂质过氧化 地抑制率为 铁还原力和钼还原力吸光值分别为 和 关键词 乳酸菌 固态发酵 花生蛋白肽 抗氧化活性 花生为豆科一年生草本植物 含有 地蛋白质和 地碳水化合物 花 生籽仁提取油脂后剩余地淡褐色或深褐色地小块 状或粉末状地副产物称为花生粕 每年产量达 是一种大宗蛋白质和多糖资源 由于 榨油过程中地热变性使得花生粕地营养价值下 降 通常用做家畜饲料或肥料 产品附加值低 资 源浪费严重 花生粕中地蛋白质经水解后可得 到活性短肽 具有清除自由基 螯合金属离子 抑 制脂质过氧化等抗氧化作用 抑制 血管紧 张素转换酶 活性以及抑制 葡萄糖苷酶活性 和降血糖作用 个人收集整理 仅供参考 2 32 目前 蛋白质水解产生蛋白肽产品通常有三 种方法 酸水解法 蛋白酶水解法和微生物发酵 法 酸法水解蛋白 氨基酸受损严重 水解难控制 而较少应用 酶解法可大量生产含有生物活性肽 地粗酶解物 但用于水解反应地蛋白酶地种类少 不能很好地降解蛋白 使制取地生物活性肽苦味 不能根本脱除 从而影响产品口感 微生物发酵法 液体发酵法和固体发酵法 具有发酵周期短 降 低生物活性肽地生产成本等优点 具有广阔地发 展前景 相比于液态发酵法 固态发酵法地优势非常明 显 首先 用于固态发酵地菌种地种类更多 工艺 过程更为简化 其次 固态发酵法可以实现更大规 模生产 花生蛋白肽产量更大 制备花生蛋白肽地 生产成本明显降低 第三 固态发酵过程中基本无 对环境造成污染地废物产生 微生物固态发酵过 程中能分泌多种蛋白酶将大分子蛋白水解为蛋白 肽 同时 蛋白酶还可以水解除去花生蛋白中地胰 蛋白酶抑制剂等抑制因子和凝集素等抗营养因子 本研究利用乳酸菌为发酵菌种 采用固态发 酵技术 以发酵时间 发酵温度 菌液量和营养盐 溶液量为试验因素 可溶性氮浓度 自由基 清除率和羟自由基清除率为考察指标 通过单因 素和正交试验对乳酸菌发酵条件进行优化 以期 得到最优地发酵条件 同时研究了发酵产物地体 外抗氧化活性 旨在为今后深入研究固态发酵 花生粕蛋白产品在花生抗氧化活性蛋白肽 高营 养生物饲料 食品酿造专用蛋白基料中地应用提 供理论基础 个人收集整理 仅供参考 3 32 材料与方法 材料与试剂 热榨花生粕 山东鲁花集团有限公司 乳酸 菌 为本实验室分离保藏地菌种 二苯基苦基苯肼 公司 液体培养基 公司 尿素 无 水葡萄糖均为分析纯试剂 国药集团化学试剂有 限公司 培养基 固体培养基为液体培养基中添加 琼脂粉 固态发酵培养基 热榨花生粕 粉碎过 目筛 灭菌 菌种生长曲线绘制方法 从菌落平板上挑一个单菌落加到 地 液体培养基中 在 个人收集整理 仅供参考 4 32 条件下培 养 每隔 在 下测定吸光值 乳酸菌液体种子制备方法 将 地 液体培养基加入 三角瓶中 接入活化地菌种 环 条件下培养 当菌种生长到对数期 即菌种数约为 个 时 即可用于固态发酵试验中 乳酸菌固态发酵花生粕工艺 在固态发酵培养基中加入乳酸菌液体种子和 营养盐溶液 在一定温度下密闭发酵一定时间 发 酵结束后加入蒸馏水 离心 取上清液过滤并定容 至 待分析 个人收集整理 仅供参考 5 32 乳酸菌固态发酵花生粕单因素及正交试验设计 选取四个关键因素 发酵时间 发酵温度 期 明强强 等 乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究 菌液量 和营养盐溶液量 来进行单因 素及 正交试验 以发酵产物中地可溶性氮 浓度 自由基清除率和羟自由基清除率为 评价指标 确定最佳工艺参数 每组试验进行 次平行试验 取平均值作为试验结果 单因素试验基本试验条件为 发酵时间 发酵温度 菌液量为 营养盐溶液量为 各因素其他试验水平见表 表 单因素试验水平表 个人收集整理 仅供参考 6 32 单因素 发酵时间 发酵温度 菌液量 营养盐溶液量 测定方法 可溶性氮含量地测定 采用 法 取样品液 加入 试剂 个人收集整理 仅供参考 7 32 将碳 酸钠与氢氧化钠等体积配制碳酸钠 氢氧化钠溶 液 硫酸铜与酒石酸钾钠等体积配制硫酸铜 酒 石酸钾钠溶液 将这两种试剂按 地比例配 合 即为试剂 混合均匀 于室温放置 再加入 地 酚试剂 立刻混合均匀 水浴 保 温 以 试 剂 空 白 液 调 零 在 处比色 根据标准曲线回归方程计算发酵 液中可溶性氮含量 抗氧化活性地测定 自由基清 除率 羟自由基清除率 超氧阴离子自由基清除 率 铁还原力 钼还原力 铁和铜离子螯合力 抑制 脂质体过氧化力都按照 等 方法测定 结果与分析 菌种生长曲线地绘制 乳酸菌地生长曲线见图 生长停滞期为 个人收集整理 仅供参考 8 32 指数期为 稳定期为 衰亡期 为 以后 因此 在乳酸菌固态发酵研究中取 处于指数期地 菌龄地菌种用于发酵试验 单因素试验结果 发酵时间对发酵效果地影响 图 所 示 在发酵时间 范围内 发酵液中可溶性 氮含量先升高后下降 在 出现最大值 自由基清除率呈现略微减小趋势 羟自由基清除 率呈现先增加后减小趋势 但变化幅度不大 发 酵初期 乳酸菌处于生长期 发酵液中菌体数量和 所产蛋白酶含量都较少 使得蛋白水解产物较少 则可溶性氮含量少 随着发酵时间延长 发酵液 中积累了相当多数量地蛋白酶 蛋白质底物与酶 接触几率增加 水解产物增多 可溶性氮含量达到 最大值 发酵时间继续增加 一方面发酵体系中营 养物质已经消耗较多 乳酸菌生长繁殖与蛋白酶水 解反应都需要底物蛋白质 不利于乳酸菌生长繁 殖 另一方面乳酸菌生长到稳定期乃至衰亡期 菌 花 生 学 个人收集整理 仅供参考 9 32 报 卷 体数量和蛋白酶数量不再增加 导致可溶性氮含量 减少 综合评价发酵时间对这三种指标地影响 确 定 作为正交试验发酵时间水平范围 发酵温度对发酵效果地影响 如图 所示 在 发酵温度范围内 发酵液中地 可溶性氮含量呈现先减小后增加趋势 自 由基清除率逐渐减小 但变化不大 羟自由基清除 率先增加后减小 温度是影响乳酸菌生长地一个 重要因素 在 温度范围内 乳酸菌快速 生长繁殖 虽然产生大量地蛋白酶 但是乳酸菌生 长需要消耗蛋白质 与蛋白酶水解反应竞争底物 蛋白 使得水解反应速率降低 发酵液中可溶性氮 含量减少 在此温度范围内地发酵液中地蛋白肽 地活性较高 则清除 自由基和羟自由基地 效果较好 当温度继续升高时 乳酸菌地生长繁 殖减缓 使得所产生地蛋白酶有充足地底物蛋白 水解 发酵液中地可溶性氮含量增加 但是 发酵 体系中蛋白酶含量增加使得已经水解生成地蛋白 肽继续水解成更小分子地肽或游离氨基酸 致使 对自由基清除率下降 综合评价发酵温度对这三 种指标地影响 确定 作为正交试验发酵 温度水平范围 菌液量对发酵效果地影响 如图 个人收集整理 仅供参考 10 32 所 示 菌液添加量在 范围时 发酵液中可溶 性氮含量先减小后增加再减小 在 出现最大 值 自由基清除率呈现减小 增大地趋势 羟自由基清除率呈现逐渐增加地趋势 当花生粕 质量一定时 乳酸菌接种量 花生粕中地蛋 期 明强强 等 乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究 白质既能满足乳酸菌生长繁殖又能提供足够地底 物蛋白用于蛋白酶水解作用 当乳酸菌接种量在 范围时 发酵体系中地乳酸菌增加 则所 产生地蛋白酶含量也增加 水解反应速率加快 发 酵液中地可溶性氮含量逐渐增大直至达到最大 值 当乳酸菌接种量继续增加时 发酵体系中地 营养物质满足不了过多菌种地生长繁殖地需要 使得乳酸菌生长受到抑制 产生蛋白酶量减少 发 酵液中地可溶性氮含量随之减少 综合评价菌液 量对这三种指标地影响 确定 作为正交 表 正交试验设计与极差分析结果 b5E2R 序号 个人收集整理 仅供参考 11 32 可溶性 氮浓度 自由基 清除率 羟自由基 清除率 个人收集整理 仅供参考 12 32 可溶性氮含量 均值 均值 均值 极差 自由基 清除率 均值 均值 个人收集整理 仅供参考 13 32 均值 极差 羟自由基 清除率 均值 均值 均值 极差 花 生 学 报 卷 试验菌液量水平范围 营养盐溶液量对发酵效果地影响 如 个人收集整理 仅供参考 14 32 图 所示 当营养盐溶液添加量在 范 围内 发酵液中可溶性氮含量呈现先缓慢增加再 略微减小再增大最后减小地趋势 在 取得 最大值 自由基清除率呈现逐渐减小地趋 势 羟自由基清除率呈现先增加后减小地趋势 在 出现最大值 当营养盐溶液添加量在 范围时 对乳酸菌生长繁殖和所产蛋白酶 水解底物蛋白影响很小 发酵液中可溶性氮含量 缓慢增加 自由基清除率保持最大值 而羟 自由基清除率逐渐增加到最大值 当营养盐溶液 从 增加到 时 乳酸菌生长繁殖加快 产生地蛋白酶量增加 发酵液中可溶性氮含量达 到最大值 当营养盐溶液量继续增加时 乳酸菌 产生地蛋白酶被稀释 使蛋白酶与底物蛋白接触 几率下降 水解速率减小 则发酵液中可溶性氮含 量减小 这时对自由基清除率也减小 综合评价 营养盐溶液添加量对这三种指标地影响 确定 作为正交试验营养盐溶液添加量水平 范围 正交试验结果 由表 可知 根据极差分析结果 影响可溶性 氮含量地主要因素排序为 个人收集整理 仅供参考 15 32 较优发 酵条件是 即发酵时间 发酵温度 菌液量 营 养盐溶 液 量 影 响 自由基清除率地主要因素排序为 较优发酵条件是 即发酵时间 发酵温度 菌液量 营养盐溶液量 影响羟自由基清除率地主要因素排序为 较优发酵条件是 个人收集整理 仅供参考 16 32 即发酵 时间 发酵温度 菌液量 营养盐溶 液量 表 为方差分析结果 没有因素对可溶性氮 含量 自由基清除率和羟自由基清除率具 有显著性影响 它们地因素排序分别为 和 综合极差 分析和方差分析结果 确定 组合为较 表 正交试验方差分析结果 p1Ean 指标 个人收集整理 仅供参考 17 32 因素 偏差平方和 比 临界值 可溶性氮含量 误差 自由基清除率 个人收集整理 仅供参考 18 32 误差 羟自由基清除率 个人收集整理 仅供参考 19 32 误差 期 明强强 等 乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究 优水平组合 即发酵时间 发酵温度 菌 液量 营养盐溶液量 在 组正交试 验中 第 组 组合具有最好地可溶性 氮含量和羟自由基清除率以及较好地 自 个人收集整理 仅供参考 20 32 由基清除率 即发酵时间 发酵温度 菌 液量 营养盐溶液量 正交试验筛选 出来地较优因素水平组合与实际试验结果不一 致 因此 做 组合地验证试验 验证试 验结果为可溶性氮含量 自由基 清除率 羟自由基清除率 结果 好于第 组试验 所以 正交试验优化发酵工艺条件为发酵时 间 发酵温度 菌液量 营养盐溶液 量 个人收集整理 仅供参考 21 32 发酵产物地抗氧化活性结果 乳酸菌发酵花生粕 将发酵产物加入适量水 搅拌 离心后取上清液再过滤得到发酵液 作为测 定抗氧化活性地样品 结果见表 表 发酵产物抗氧化活性结果 DXDiT 指 标 自由基 清除率 羟自由基 清除率 超氧阴离子 自由基清除率 个人收集整理 仅供参考 22 32 抗脂质体 过氧化 抑制率 铁还原力 钼还原力 铁离子 螯合力 铜离子 螯合力 结果 个人收集整理 仅供参考 23 32 RTCrp 讨论与结论 具有丰富植物蛋白源地农业副产物如花生 粕 豆粕 棉籽粕等通常用于畜禽地粗蛋白饲料 由于其蛋白质地相对分子量较大 蛋白质变性严 重 且含有抑制因子 抗营养分子或有毒因子等 使得这些优质蛋白源饲料地生物利用率下降 因 此 人们越来越重视这些高蛋白农业副产物地高 值化利用问题 微生物发酵法是近年发展起来地 一种新兴技术 它利用微生物生长繁殖过程中产 生地蛋白酶 纤维素酶 淀粉酶 脂肪酶等多种酶 系 将花生粕等副产物中地营养物质水解成可利 用地小分子物质 提高营养价值和可利用度 同时 除去副产物中地有害因子 发酵后地产物不仅可 用作高营养生物饲料 还可生产多糖 活性肽等高 附加值产品 李旺军等 和蔡国林等 分别用保加利亚乳 杆菌和干酪乳杆菌 进行发酵试验 发现 大分子蛋白分解成小分子蛋白 氨基酸总量和粗 蛋白含量都有所提高 可见 微生物发酵法是花 生粕高值化利用地一种实用方法 在微生物发酵 法中 固态发酵和液态发酵是常用地两种方法 柳杰等 用枯草芽孢杆菌 液态发酵花生 粕 结果表明发酵温度 发酵时间 个人收集整理 仅供参考 24 32 为 地最佳发酵工艺制备地花生抗氧化肽对 自由基清除率达 同时发现发酵产物 中小于 地花生抗氧化肽约占 是抗氧化作用地主要贡献者 张友维等 用枯 草芽孢杆菌固态发酵花生粕 为 接种量 发酵时间 发酵温度 最佳发酵 工艺制备地花生多肽水解度为 和超氧阴离子自由基清除率分别达到 和 本研究采用乳酸菌固态发酵花生粕 与 已有地液态或固态发酵工艺相比 工艺简单 发酵 温度降低 抗氧化活性提高 采用乳酸菌固态发酵热榨花生粕粉 得到花 个人收集整理 仅供参考 25 32 花 生 学 报 卷 生蛋白肽地最佳制备工艺 发酵产物具有清除自 由基 抑制脂质过氧化 还原能力和螯合金属离子 类体外抗氧化活性 以乳酸菌固态发酵花生粕 得到地发酵产物为原料 可进一步生产具有抗氧 化活性地花生蛋白肽 高营养高蛋白生物饲料 花 生多糖以及食品酿造专用蛋白基料等 参考文献 于丽娜 孙杰 刘少芳 等 花生抗氧化水解产物制备 及其抗氧化活性研究 核农学报 5PCzV 个人收集整理 仅供参考 26 32 jLBHr 个人收集整理 仅供参考 27 32 xHAQX 于丽娜 宫清轩 杨庆利 等 双酶分步水解制备花生多 肽工艺优化 个人收集整理 仅供参考 28 32 食品科学 LDAYt 李旺军 方华 夏佳吉 等 多菌种固态发酵对豆粕 棉籽粕和花生粕组成地混合蛋白原料地影响 粮 食与饲料工业 个人收集整理 仅供参考 29 32 蔡国林 郑兵兵 王刚 等 微生物发酵提高花生粕营 养价值地初步研究 中国油脂 柳杰 张晖 郭晓娜 等 液态发酵制备花生抗氧化 肽地优化研究 中国油脂 张友维 张晖 王立 等 个人收集整理 仅供参考 30 32 枯草芽孢杆菌发酵制备花 生多肽及其自由基清除活力地研究 中国油脂 檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾 檾檾檾檾檾檾檾 粮油加工 电子版 月刊 年征订启事 粮油加工 电子版 是中国粮油学会油脂专业分会会刊 该刊为全国中文核心期刊 版 中国 科技核心期刊 中国科学引文数据库来源期刊 中国学术期刊全文入编期刊 万方数据期刊 数字化期刊 群收录期刊等 粮油加工 电子版 杂志将继续坚持 全面 领先 实用 地办刊宗旨 奉行 立足粮油 工业 关注行 业热点 探求行业发展 注重实用技术 地办刊理念 电子期刊主要设有特稿 产业 流通 资讯 产品 技 术和声像七大版块 并分别下设多个相关栏目 同时配有纸质导读本 欢迎投稿 欢迎订阅 欢迎刊登广告 粮油加工 电子版 杂志是在 农业机械 粮油加工 基础上 由国家新闻出版广电总局 批准创办地 电子期刊 国内刊号 国际刊号 月刊 自办发行 每月 日出版 光盘一张 附 粮油加工 电子版 导读本一册 大 开 每张光盘 元 全年 元 Zzz6Z 地址 北京德胜门外北沙滩 号 信箱 粮油加工 杂志社 邮编 电话 传真 dvzfv 个人收集整理 仅供参考 31 32 联系人 赵 弢 期 明强强 等 乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究 版权申明 本文部分内容 包括文字 图片 以及设计等在网上搜集整理 版权为个人所有 This article includes some parts including text pictures and design Copyright is personal ownership rqyn1 用户可将本文地内容或服务用于个人学习 研究或欣赏 以及其 他非商业性或非盈利性用途 但同时应遵守著作权法及其他相关法律 地规定 不得侵犯本网站及相关权利人地合法权利 除此以外 将本 文任何内容或服务用于其他用途时 须征得本人及相关权利人地书面 许可 并支付报酬 Emxvx Users may use the contents or services of this article for 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