巴戟天的组织培养与栽培技术研究进展

巴戟天的组织培养与栽培技术研究进展巴戟天的组织培养与栽培技术研究进展 摘要 概述了通过组织培养技术再生巴戟天完整植株的影响因素 包括外植体 种类 消毒程序 培养基 培养条件等 以及巴戟天高产栽培的主要技术及其 研究成果 并提出巴戟天组织培养技术现存的问题和今后的发展方向 关键词 巴戟天 组织培养 栽培 研究进展 Abstract Summarizes by tissue culture technology regeneration morinda officinalis complete plant influencing factors including the followed body type disinfection procedures culture medium culture conditions as well as morinda officinalis high yield cultivation technique and the main research results and put forward the morinda officinalis tissue culture technology existing problems and the future direction of development Key words Morinda officinalis tissue culture cultivation research progress 巴戟天为茜草科 Rubiaceae 巴戟天属多年生攀援性木质藤本 别名巴戟 巴吉 鸡肠风 以肉质根入药 是我国著名的 四大南药 之一 其主要化学 成分为蒽醌类化合物 糖类 有机酸类 氨基酸类 环烯醚萜类以及人体所必 须的微量元素 味甘 辛 性微温 具有补肾壮阳 强筋骨 祛风湿的功效 在临床上主要用于治疗阳痿遗精 宫冷不孕 月经不调 少腹冷痛 风湿痹痛 筋骨痿软等症 1 随着现代医学技术的不断发展以及对巴戟天开发不断深入 巴戟天的应用 范围不断扩大 市场需求量逐年增加 由于长期的滥采滥挖 巴戟天野生资源 受到较大的破坏 而巴戟天栽培种的产量和质量不能满足市场的需要 巴戟天 组织培养是有效可行的无性繁殖途径 不仅具有繁殖快 不受场地 季节和环 境条件限制等诸多优点 也克服了扦插繁殖速度慢 难生根 繁殖率低的缺点 2 为了使我国巴戟天的生产及质量满足市场及人们生活的需求 同时保护野生资 源不再被肆意采挖而导致珍贵种质资源的流失 以优良种质快速繁殖为目的 筛选出具优良性状的巴戟天优良单株 如产药部位产量高 有效成分含量高的 巴戟天单株 并以此作为组培快繁的材料 对巴戟天进行组培快繁研究 为保 护巴戟天野生种质资源及巴戟天的苗木工厂化育苗提供技术支撑 从而促进巴 戟天中药材的现代化进程 具有重要的现实意义 3 本文综述近年来巴戟天组 织培养快繁和栽培技术的研究进展 并对其存在的问题和进一步研究的方向进 行探讨 为进一步做好巴戟天的规范化种植 GAP 和深入研究与开发利用巴 戟天资源提供参考 1 巴戟天组织培养巴戟天组织培养 1 1 外植体的选择与处理外植体的选择与处理 不同种类的植物以及同种植物不同的器官对诱导条件的反应是有差异的 有的部位诱导成功率高 而有的部位很难脱分化 有时 即使脱分化 再分化 频率也很低 或者只分化出芽而不长根 或者只长根不长芽 4 因此 外植体 的取材和处理是组织培养成功与否的关键 不同植物用于诱导培养的外植体的 选材和处理也不尽相同 常选用的外植体有 根 须根 茎 块茎 鳞茎 球 茎 芽 子叶 叶片 叶柄 鳞片 花蕾 花序 花芽 花瓣 花药 花丝 子房 果肉 果实 原生质体 珠芽等植物体的各个部位 目前为止 巴戟天 进行过离体培养的有 6 种外植体 包括茎段 茎尖 叶片 果实 腋芽 顶芽 等 1 1 1 外植体选择的季节外植体选择的季节 何宗明等 5 通过对 2008 年 4 月 7 月 8 月 10 月不同月份采取的当年生 巴戟天带芽茎段外植体研究发现 在酷暑难耐的 7 月至 8 月 光照最强 空气 较干燥 植物中促进生长的内源激素含量最高 外植体污染率较低 其成活率 高于 4 10 月份 张敏 6 也对 2008 年 4 月 7 月 8 月 10 月不同月份采取的 当年生巴戟天茎段外植体研究发现 在 7 月至 8 月 气温高 光照最强 空气 较干燥 外植体的污染率及褐化率均较低 成活率高 均高于 4 10 月份 其 中 7 月成活率高于 8 月份 故采集巴戟天外植体的最佳月份为 7 月 张敏还对 阴雨天 晴天 08 00 10 00 晴天 14 00 15 00 连续 3 天及以上无雨的 14 00 15 00 不同天气采取的当年生巴戟天茎段外植体研究发现 连续 3 天及 以上无雨的 14 00 15 00 取茎段外植体培养 污染率最低 为 48 89 成 活率也最高 达到 48 89 可见巴戟天组培快繁外植体宜在 7 月连续 3 天及 以上无雨的 14 00 15 00 取材 1 1 2 外植体的消毒处理外植体的消毒处理 外植体表面的灭菌中常用的消毒剂使用方法有 单一消毒剂灭菌 联合消 毒剂灭菌 混合消毒剂灭菌和联合与混合并用 张敏等比较了单一消毒剂灭菌 和联合消毒剂灭菌的消毒效果 发现 0 1 升汞和 2 次氯酸钠联合使用的消毒 效果最优 6 原因可能是复合使用消毒剂可以减少损伤大的升汞消毒时间而增 加低浓度低损伤不易残留的次氯酸钠消毒时间 既降低污染率又降低褐化率 从而减少损伤提高成活率 7 外植体的消毒处理程序大致相同 其流程如下 巴戟天外植体 用洗洁精 或 5 洗衣粉漂洗 5min 流水冲洗 2 5h 用滤纸吸去多余的水分 移入超净 工作台 不同的消毒处理方案 置于灭菌培养皿中 切小段 长 0 5 1 5cm 带 有 1 个腋芽或顶芽 切除药液接触过的伤口 接种 诱导培养 5 6 9 12 1 21 2 培养基及培养条件筛选培养基及培养条件筛选 培养基是外植体生长的营养基础 是植物离体培养成功与否的重要因素 不同植物所使用的培养基有所差别 常用的培养基有 MS B5 White Heller ER Nitsch NT 等 此外 激素 碳源 光照 温 度 气体状况 季节 pH 值等因素对培养也有较大的影响 8 1 2 1 基本培养基的筛选基本培养基的筛选 贺红 9 等以 MT 培养基为基本培养基 附加不同浓度的 BA 和 NAA 组成不 同的培养基 观察巴戟天不同外植体茎尖 带节茎培养的出芽率 带节茎出芽 率最高 达 97 5 茎尖次之 为 76 2 黄宁珍 10 等以巴戟天的顶芽及嫩茎 节为外植体 以 MS 为基本培养基 通过添加不同的激素种类及激素浓度的配 比 建立了巴戟天的组培快繁体系 陈伟 11 等以巴戟天苗的叶片 茎尖 茎段 为外植体 通过诱导出不定芽进行快速繁殖 该实验所用基本培养基为 MS 培 养基 得到了 95 的不定芽诱导率与 85 的生根率 说明 MS 培养基适用于巴 戟天的组培 林美珍 12 等以巴戟天幼嫩种子中的胚为外植体进行组织培养 所 用基本培养基为 MS 可见巴戟天组培大多数以 MS 为基本培养基 1 2 2 植物生长调节物质的筛选植物生长调节物质的筛选 基本培养基能保证培养物的生存与最低生理活动 但只有配合使用适当的 外源生长调节剂 才能诱导细胞分裂 愈伤组织生长以及芽 根的分化等 植 物生长调节剂是由人工合成的 在植物体内具有生理活性的 以较小的剂量可 起到较大的调节效能的化合物 13 一般认为 生长素和细胞分裂素的浓度是器 官分化和植株生长的重要条件 14 巴戟天组织培养常常用到的生长素有 NAA IBA 2 4 D 等 为了调节细胞分裂 细胞分化和形成 生长素时常 需和细胞分裂素联用 有时为了诱导生根也加入微量的赤霉素 15 有关植物生 长调节物质在巴戟天组织培养快繁中的应用见表 1 表表 1 巴戟天快繁采用的培养基及植物生长调节物质巴戟天快繁采用的培养基及植物生长调节物质 外植体诱导形成的 器官或组织 适宜的培养基和植物生长调节物质配比器官或组织 诱导率 文献 茎段 嫩芽 离体胚 不定芽 不定根 愈伤 不定芽 不定根 愈伤 不定芽 MT 1 0mg L 1BA MS 1 0mg L 16 BA 0 05mg L 1IBA MS 1 0mg L 16 BA 0 5mg L 1NAA MS 1 0mg L 1BA 0 05mg L 1IBA MT 0 2 0 5mg L 1NAA 1 2MS MS 1 2MS 0 4 0 8mg L 1IBA MS 0 5mg L 1NAA 0 1mg L 1BA MS 0 5mg L 1NAA 0 5mg L 12 4 D 0 7 mg L 1BA 5 0mg L 1GA3 MS 0 5mg L 1NAA 6 0mg L 1BA 1 0 mg L 1GA3 1 2MS 0 2mg L 1IAA 0 4mg L 1NAA MS 2 0mg L 12 4 D 0 5mg L 16 BA MS 1 0mg L 16 BA 97 5 74 9 95 80 0 100 85 100 86 7 100 86 7 84 6 74 0 34 4 9 6 11 10 9 6 11 10 16 16 17 17 12 12 从表 1 可以看出 目前巴戟天组培快繁采用的外植体主要是茎段 嫩叶和 离体胚 在不同培养基和生长调节物质的调节下 同一外植体可以诱导出不同 的器官或组织 而不同的外植体也可以诱导出相同的器官或组织 其中 嫩芽 和离体胚经过诱导均可得到愈伤组织 但嫩芽诱导率最高 达 86 7 是诱导 愈伤组织的理想外植体材料 茎段 嫩芽和离体胚均可作为诱导不定芽的外植 体 但茎段和嫩芽的诱导率较高 其中嫩芽在培养基 MS 0 5mg L 1NAA 0 5mg L 12 4 D 0 7 mg L 1BA 5 0mg L 1GA3 赤霉酸 中不定芽诱导率 最高达 100 主要是因为培养基中加了 GA3 而 GA3促进植物的生长发育 主要是通过细胞数目的增加和细胞的伸长 18 从茎段和嫩芽诱导不定根的诱导 率可以看出 不添加任何生长调节剂的 1 2MS 培养基的诱导效果最好达到 100 有关机制有待进一步研究 1 2 3 糖种类与浓度糖种类与浓度 糖的种类和用量是植物组织培养能否成功的重要因素之一 不仅作为碳源 影响培养物的营养状况 而且在某些情况下还会影响器官分化 一般巴戟天外 植体离体培养基中加入浓度为 3 的蔗糖 19 这是因为蔗糖不仅作为碳源影响 到培养物的营养状况 而且在某些情况下还会影响到细胞的分化 而木质部成 分的分化 特别是管胞分子的分化形成 往往是器官发生的先决条件 20 1 2 4 酸碱度 酸碱度 pH 培养基的酸碱度对外植体的生长没有直接影响 但存在一定的间接影响 通常培养基 pH 值以 5 0 6 2 为适宜 合适的 pH 值不仅有益于外植体生长 而 且有助于培养基凝固 当 pH 值高于 6 5 时 培养基会变硬 低于 5 0 时 琼脂 不能很好地凝固 巴戟天外植体在 pH 值 5 8 6 2 时生长良好 1 2 5 温度 湿度 光照强度和光周期温度 湿度 光照强度和光周期 不同光照强度 光周期及温度条件对植物组织培养有显著影响 巴戟天外 植体愈伤组织的诱导 继代和不定芽的分化等在温度为 25 1 湿度 70 80 光照强度为 2000lx 光照时间 12h d 时均生长良好 6 21 2 巴戟天栽培技术巴戟天栽培技术 陈震等根据多年来中药材的科研和广大药农的生产经验总结出中药材栽培 技术的 4 个主要特点 中药材的种类多 主要依靠栽培的中药材约有 250 多 种 中药材栽培技术的复杂性 有些中药材要求严格的生态环境 中药材的 药用部位不同 栽培技术也不同 共生和寄生类药材有比较特殊的栽培方法 不同种类药材的繁殖方法也有许多不同 中药材生产既要重产量也要重质量 重点要发展道地药材 以保证治疗 中药材产后加工也是不可忽视的一环 要严格遵守操作规程 确保质量要求 并做到丰产又丰收 22 根和根茎类药用 植物的栽培应抓住四大环境要素 温度 光照 水 土壤 和三个生理调控 主根与侧根 地上部与地下部 营养生长与生殖生长 的要点 采取相应的 技术措施 以使根和根茎类药用植物达到高产优质的目的 23 李爱平研究发现 影响巴戟天生长发育的主要因素有荫蔽度 土壤质地 温度 湿度 坡位 坡 向和种植密度 并得出巴戟天宜生长在疏松 深厚 具有肥性的 PH 为 5 6 7 0 的灰化红土壤中 最适宜的生长温度在 20 25 最适宜的湿度在 25 一 30 种植密度为 2000 株为宜 24 2 12 1 选地选地 苗地一般选择在缓坡地或山坡下较为平坦的地方 除去杂草及灌木层 留 林木层以保持适当的荫蔽 深翻松土 使充分风化后起垅 种植地宜选择 20 30 度的坡地 阳光充足南面或东南面的山坡疏林下 要求土层深厚肥沃 腐殖质丰 富 新开垦的红 黄砂壤土 25 2 22 2 繁殖方法繁殖方法 过去巴戟天繁殖方法多是采用多节藤蔓作插条进行扦插繁殖 陆善旦采用 巴戟天单节藤蔓扦插育苗取得成功 并介绍了此方法 26 韩德聪等用三十烷醇 吲哚丁酸 萘乙酸三种不同浓度植物激素处理巴戟插条后 发现其成活率均有 不同程度的提高 27 卫锡锦等通过对比扦插育苗 种子育苗 激素处理 弓形 棚地膜覆盖实验研究发现 种子繁殖比扦插繁殖具有较大的优越性 用 IAA 和 NAA 处理巴戟天插条 能促进生根 其中以 500 1000ppm 的 NAA 蘸根处理效 最好 弓形棚地膜覆盖 增加了温湿度 为种子的萌发生长 擂条的成活生根 创造了一个良好的小环境 使其成苗率提高 是巴戟天育苗的一种有效方法 28 赵胜德等经过多年考查与试验 介绍了种子繁殖方法 也认为巴戟天改用种子 繁殖较好 可以相对缩短巴戟天商品种植的周期 提高巴戟天的产量及质量 29 目前 国内学者关于组织培养方面有较多研究 30 但是仅限于大田里生长的巴 戟天带节茎段或茎芽直接做为外植体进行快速繁殖 而茎段容易被细菌和真菌 菌丝寄生 难以做到彻底消毒 故影响到再生的成活率 2 32 3 病虫害防治病虫害防治 巴戟天的病害有茎基腐病 根结线虫病 煤烟病等 虫害有蚜虫 蓟马 蚧壳虫等 茎基腐病发病初期 可用1 3的石灰 草木灰混合撒施 或用80 代 森锌500倍液喷雾 每隔7 10天喷1次 连续2 3次 发现根结线虫病的植株连 根拔掉烧毁 用3 呋喃丹颗粒剂进行土壤处理 每667m2用量1 5kg 春夏季是 蚜虫 蓟马 蚧壳虫盛发期 可用40 氧化乐果乳剂1000倍液或50 马拉硫磷 800倍液防治 31 2 42 4 采收与加工采收与加工 巴戟天种后第 5 6 年就可采收 采收期在秋季 因为这时根内积存有丰富 的营养物质 加工成品质优 采挖时宜将植株周围 50cm 深的土挖松扒开 不 伤其根 挖取根部 洗净泥土 除去须根 晒至六 七成干 轻轻捶扁 将粗条 者切成 9 13cm 长的段 中细条者切成 6 10cm 长的段 晒至六七成干 待根质 柔软时 用木捶轻轻捶扁 但切勿打烂或使皮肉碎裂 按商品要求切成 2 4 寸 的小段 按粗细分级后分别晒至足干 即成商品 以肉质粗壮 心木细 色紫 红 无杂物者为佳 老产区常用开水泡烫或蒸约半小时后才晒 则色更紫 质 更软 品质更好 3 巴戟天组织培养过程中存在问题巴戟天组织培养过程中存在问题 在植物组织培养过程中 常发生褐变 污染 玻璃化现象三大难题 严重 影响了组织培养材料的正常发育 给组织培养带来了一定的困难 32 目前已在 巴戟天组培快繁方面取得了较大进展 但仍存在一些问题 主要包括以下几个 方面 1 由细菌和真菌造成的污染问题 2 由外植体的生理状态 基因型 外 植体大小及取材时间 外植体消毒方式 培养基配方 光照强度或者植物生长 调节剂使用不当等引起的褐化现象 3 在培养过程中组织结构发育畸形 玻璃 化现象 4 长期离体培养 细胞易发生不良变异 产物的合成能力下降或损失 5 脱毒研究和检查方法尚待完善 在今后的研究中 应在以下几个方面做深入 研究 1 从优化培养条件和改善培养方法入手 进一步优化植株再生程序 防 止外植体和愈伤组织褐化 试管苗的玻璃化和生根苗叶片的黄化及脱落 提高 试管苗生根率和缩短生根时间 2 利用基因工程技术 培育优良新品种 3 通 过将外源基因转入 定向修饰目的性状或化合物 使其具有某种抗性或提高其 有效成分的合成量 从而获得更高的经济效益 总之 巴戟天集多种药用价值 和保健功效于一身 具有广阔的开发前景 有必要对巴戟天组织培养进行更深 入的研究 以有利于人类更好地开发利用巴戟天资源 纵观巴戟天研究现状 今后巴戟天栽培研究的目标是 1 良种的多样化及 合理配置 2 水肥调控技术及不同立地条件下不同栽植方式的巴戟天高效栽培 技术研究 3 生态调控下的病虫害综合防治技术研究及预测预报体系的构建 4 巴戟天生产技术标准的完善和推广 参考文献 1 国家药典委员会编 中华人民共和国药典 S 2010年版一部 北京 化学工业出 版社 75 76 2 吴安湘 金晓玲 熊芳 珍稀濒危植物组织培养研究进展 J 西北植物学报 2006 26 1 211 216 3 徐鸿华 詹若挺 广东中药材生产的规范化 产业化建设 J 世界科学技术 中药现代化 2003 5 2 50 54 4 曹孜义等 实用植物组织培养技术教程 M 兰州 甘肃科学技术出版社 2002 5 何宗明等 巴戟天优良材料茎段组织培养污染率控制方法 J 安徽农学通 报 2009 15 13 53 54 135 6 张敏 巴戟天优良材料筛选与组培快繁技术 D 福建农林大学 2010 7 胡凯等 植物组织培养污染原因分析及外植体的消毒 J 安徽农业科学 2007 35 3 680 681 8 李玉萍等 绞股蓝组织培养技术研究进展 J 江苏农业科学 2012 40 9 55 58 9 贺红等 巴戟天离体培养及植株再生的研究 J 广州中医药大学学报 2000 17 4 353 354 10 黄宁珍等 巴戟天组织培养和快速繁殖研究 J 广西植物 2007 27 1 127 131 11 陈伟等 巴戟天的组织培养及快速繁殖 J 热带农业科学 2006 2 8 9 13 12 林美珍等 巴戟天的组织培养和多倍体诱导 中国中药杂志 2011 17 2325 2328 13 沈齐英 吕久琢 潘九堂 植物激素和植物生长调节剂发展现状 J 北京石 油化工学院学报 2001 9 1 6 8 14 谷瑞升 蒋湘宁 郭仲琛 植物离体培养中器官发生调控机制的研究进展 J 植 物学通报 1